FAF1、Livin蛋白在胃癌组织中的表达及临床意义

马一倩，汪 莉，马 宏，李保存，赵桂花(青海卫生职业技术学院护理学系，青海 80000;天津市儿童医院消化内科;通讯作者，E-mail:mayiqian680504@63.com)

胃癌是严重危害人体的恶性肿瘤之一，我国胃癌发病率和死亡率均高于全球平均水平，严重威胁人民的生命和健康，并造成巨大的经济负担及损失［1］。机体细胞凋亡的调控障碍是胃癌发生、发展的重要机制之一，Fas相关因子1(Fas-associated factor 1，FAF1)是一种能够诱导Fas 介导细胞凋亡的促凋亡蛋白，多项研究表明其在胃癌组织中特异性低表达［2-4］;Livin基因是最新发现的一种凋亡蛋白抑制因子(inhibitor of apoptosis protein，IAP)，能与多种caspase结合而抑制细胞凋亡的发生［5］。研究二者在胃癌中的表达水平及其相关性对揭示胃癌发生机制有着指导意义，为进一步探索胃癌的诊断、治疗提供重要依据。

1 材料与方法

1.1 一般资料

收集2011-12～2012-05青海大学附属医院53例胃癌患者的肿瘤组织手术标本(经病理证实)作为研究对象(胃癌组)，其中最大年龄76岁，最小年龄33岁，平均(56.34±10.98)岁。所有胃癌患者术前未经过放、化疗。同时收集正常胃黏膜组织标本50例设为对照组，对照组年龄、性别与胃癌组无统计学差异。

1.2 主要试剂

实验用试剂兔抗人FAF1多克隆抗体(稀释浓度为1∶400)购于北京博奥森生物技术有限公司;兔抗人Livin多克隆抗体及SABC免疫试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司。

1.3 主要方法

准备石蜡切片:标本收集后经10%中性甲醛固定，常规石蜡包埋，石蜡切片机连续4 μm切片三张，烤片机干燥30 min，60℃恒温烤箱烘烤过夜。第一张切片经二甲苯和不同梯度酒精脱蜡后进行HE染色、脱水及封固后阅片。第二、三张切片采用免疫组化染色SP法:切片常规脱蜡后0.01 mol/L柠檬酸加热修复抗原，自然冷却至室温;0.3%H2O2室温下孵育10 min阻断内源性过氧化物酶，0.01 mol/L PBS液缓冲3次，间隔时间5 min;滴加一抗后置于37℃温箱孵育2 h，室温下复温20 min;PBS液缓冲3次后滴加生物素标记的山羊抗兔或抗鼠抗体，37℃温箱孵育30 min后缓冲三次;DAB液显色后复染、返蓝，最后脱水、封固阅片。用PBS液代替一抗作为阴性对照。

1.4 结果判断标准

FAF1、Livin蛋白阳性染色均见于细胞质中，为棕黄色颗粒。FAF1蛋白及Livin蛋白表达水平按照半定量记分方法，每例随机观察5个高倍视野(×400)。阳性细胞数计分:阳性细胞≤5%为0分，6%-25%为1分，26%-50%为2分，51%-75%为3分，＞75%为4分;阳性强度积分:无着色为0分，黄色为1分，棕黄为2分，棕褐色为3分;阳性分级:将阳性细胞率与染色强度两者积分相乘0分为(-)，1 分为(+)，2-4 分为(++)，5-8 分为(+++)，9-12 分为(++++);其中(-)-(+)为阴性，(++)-(++++)为阳性。

1.5 统计学分析

应用SPSS11.5统计软件对数据进行统计学分析，两组之间FAF1、Livin蛋白表达水平之间的差异性采用χ2检验分析，二者相关性采用Spearman等级相关分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 FAF1、Livin蛋白在胃癌组织中的表达

FAF1、Livin蛋白均见于细胞质中表达(图1，2，见第247页)FAF1在胃癌组的表达水平明显低于正常组(χ2=32.30，P ＜0.05);Livin 蛋白在胃癌组的表达水平明显高于正常组(χ2=36.96，P ＜0.05，见表1)。

图1 FAF1蛋白在胃癌组织中的表达Figure 1 Expression of FAF1 protein in gastric cancer tissues

图2 Livin蛋白在胃癌组织中的表达Figure 2 Expression of Livin protein in gastric cancer tissues

表1 FAF1、Livin蛋白在胃癌组及正常组的表达例(%)Table 1 Expression of FAF1 and Livin protein in gastric cancer cases(%)

2.2 FAF1、Livin蛋白在胃癌不同临床病理特征中的表达

FAF1蛋白在高、中分化组的表达水平高于低、未分化组(P＜0.05);Livin蛋白在肿癌＞5 cm组、浸润至浆膜层组、低-未分化组、淋巴结转移组、TNM分期Ⅲ-Ⅳ组的阳性表达水平分别高于癌肿≥5 cm组、浸润至肌层组、高-中分化组、淋巴结未转移组、TNM分期Ⅰ-Ⅱ组(P＜0.05，见表2)。

2.3 FAF1、Livin蛋白在胃癌组织中的表达相关性

经Spearman等级相关分析，胃癌组织中FAF1与Livin蛋白的表达无相关性(rs=0.307，P＞0.05)。

3 讨论

机体细胞凋亡的调控障碍是肿瘤发生、发展的重要机制之一。FAF1蛋白是一种促凋亡因子［1］。可存在于不同细胞的细胞核和/或胞质中，定位于染色体1q32区，由650个氨基酸组成［2，3］。其181-381位氨基酸序列可以与Fas介导细胞凋亡途径中的FADD(Fas associated death domain，Fas相关死亡区域)和半胱氨酸蛋白酶-8(caspase-8)的DED区(death effecter domain，死亡效应结构域)相互作用，从而促进细胞凋亡的发生;其次还可以与蛋白激酶CK2结合成复合物，当DNA受损时抑制CK2作用，从而使凋亡显著增加［6，7］。多位学者研究FAF1蛋白在人类不同器官肿瘤中的表达情况，发现FAF1只在胃癌组织中是特异性低表达［8］，其在胃癌的早期诊断中的作用逐渐引起研究者的重视。Livin基因是最新发现的 IAP家族成员，定位于染色体20q13，其氨基端的BIR结构域包含抗凋亡所必需的半胱氨酸和组氨酸的复合物，可以与caspases家族中的多个成员相互作用，从而抑制caspase级联激活反应，抑制细胞凋亡的发生［5］。多项研究证实Livin蛋白在正常成人大多数终末分化组织中低表达或不表达，在喉癌、黑色素瘤、胰腺癌、肺癌等许多肿瘤及胚胎组织中呈高表达［9-14］，目前国内对FAF1、Livin蛋白在胃癌组织中的表达相关性研究少有报道，而应用Livin的基因治疗成为研究热点。

表2 FAF1、Livin蛋白在胃癌不同临床病理特征中的表达Table 2 Relationship between FAF1，Livin protein expression and clinicopathological features of gastric cancer

本研究结果显示:FAF1蛋白在胃癌组织的表达水平明显低于正常组织，二者比较差异有统计学意义(χ2=36.96，P ＜0.05)。此结果与刘爱群等［15］研究结果基本一致，但表达率略低。FAF1蛋白的表达水平与胃癌细胞分化程度有关，细胞分化程度越低FAF1蛋白表达水平就越低，此结果与王晓凤等［16］研究结果相同。提示FAF1的表达缺失可能抑制肿瘤细胞的凋亡，阻碍了细胞分化，导致肿瘤细胞的恶性增生而发生胃癌。结合研究显示FAF1仅在人胃癌中特异性低表达，认为监测FAF1的表达水平可能为胃癌的早期发现及判断分化程度提供重要依据;FAF1蛋白在不同年龄、性别、肿瘤部位、淋巴转移、浸润深度、肿瘤大小、TNM分期等各组间未见明显差异(P＞0.05)。此结果与王健莉等［17］研究显示FAF1蛋白的表达水平与肿瘤大小有关不符，有待今后进一步研究。

本研究结果显示:Livin蛋白在胃癌组织中的表达水平明显高于正常胃黏膜组织，二者比较具有显著性差异(χ2=36.96，P ＜0.05)。提示 Livin 的高表达增加了肿瘤细胞的抗凋亡能力，促进了其恶性增殖，导致了胃癌的发生。Livin在癌肿＞5 cm组、浸润至浆膜层组、低-未分化组、淋巴结转移组、TNM分期Ⅲ-Ⅳ组的阳性表达率明显高于癌肿＜5 cm组、浸润至肌层组、高-中分化组、淋巴结未转移组、TNM分期Ⅰ-Ⅱ组 (P＜0.05)。此结果与Liu等研究结果相似［18］。提示胃癌患者Livin蛋白阳性表达率增高，则胃癌恶性程度高、易发生转移、术后复发率高、预后差。结合文献报道Livin蛋白的表达有肿瘤组织特异性，认为监测Livin蛋白的表达水平可能为胃癌的诊断及预后判断提供重要依据，同时随着有关研究的进一步深入，以Livin为靶向的基因治疗将为胃癌的治疗开辟新途径。

FAF1、Livin蛋白之间经相关性分析显示二者表达无相关性，提示FLIP蛋白和Livin蛋白虽然都作用于细胞凋亡过程中，但在胃癌发生发展过程中二者之间可能无相互协同或抑制作用。

综上所述，FAF1和Livin蛋白在胃癌发生、发展中分别起促进和抑制细胞凋亡的作用，而二者之间无相互协同或抑制作用。国内外研究发现，FAF1在人胃癌中呈特异性低表达，而Livin蛋白的表达有肿瘤组织特异性，因此监测FAF1和Livin蛋白的表达水平可能为胃癌的早期发现及推断演进方向提供重要依据，同时以Livin为靶向的基因治疗为胃癌的治疗带来新思路。

致谢：本研究在青海大学附属医院消化科及病理科的大力协助下完成，特此表示感谢!

［1］郑朝旭，郑荣寿，陈万青.中国2009年胃癌发病与死亡分析［J］.中国肿瘤，2013，22(5):327-332.

［2］Chu K，Niu X，Williams LT.A Fas-associated protein factor，FAF1，potentiates Fas-mediated apoptosis［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1995，92(25):11894-11898.

［3］Adham IM，Khulan J，Held T.Fas-associated factor(FAF1)is requried for the early cleavage-stages of mouse embryo［J］.Mol Hum Reprod，2008，14(4):207-213.

［4］王健莉，赵俊卿，苗杰，等.FAF1，FLIP在乳腺癌中的表达及相关性研究［J］.现代肿瘤医学，2011，18(1):92-94.

［5］Kosof GM，Gomes BC.Livin，a novel inhibitor of apoptosis(IAP)protein family［J］.Biol Chem，2001，276(5):3238-3246.

［6］Ryu SW，Kim E.Apoptosis induced by human Fas-alsociated factor 1，hFAFI，requires its ubiquitin homologous domain，but not the Fas binding domain［J］.Biochem Biophys，2001，286(5):1027-1032.

［7］Ryu SW，Kim E.Apoptosis induced by human Fas-alsociated factor 1，hFAF1，requires its ubiquitin homologous domain，but not the Fas-binding domain［J］.Biochem Biophys，2001，286(5):1027-1032.

［8］Bjorling-Poulsen M，Seitz G，Guerra B，et al.The pro-apoptot-ic FAS-associated factor1 is specifically reduced in humangastric carcinomas［J］.Int J Oncol，2003，23(4):1015-1102.

［9］Ashhab Y，Alian A，Polliack A，et al.Two splicing variants of a new inhibitor of apoptosis gene with different biological property and tissue distribution pattern［J］.FEBS Lett，2001，495(1/2):56-60.

［10］Kim DK，Alvarado CS，GU L，et al.Expression of inhibitor-of-apoptosis protein(IAP)Livin by neuroblastoma cell:correlation with prognostic factors and outcome［J］.Pediatr Dev Pathol，2005，8(6):621-629.

［11］Dazzaniga P，Gradilone A，Giu liani L，et al.Expression and prognostic significance of Livin/survivin and other apoptosis-related genes in the progression of superficial bladder cancer［J］.Ann Oncol，2003，14(1):85-90.

［12］Wagerner N，Vetter C，Bedke J，et al.Expression of inhibitor of apoptosis protein Livin in renal cell carcinoma and non-tumorous adult kidney［J］.Br J Cancer，2007，97(9):1271-1276.

［13］Nedelcu T，Kubista B，Koller A，et al.Livin and Bcl-2 expression in high-grade osteosarcoma［J］.J Cancer Res Clin Oncol，2008，123(2):237-244.

［14］王阳，薛玲珑，高文胜，等.Livin与胃癌关系的研究进展［J］.中国医药指南，2013，11(5):63-65.

［15］刘爱群，葛莲英，邵红，等.Fas相关因子1和Survivin在胃癌中的表达及其与患者预后的关系［J］.中华临床医师杂志，2011，5(21):6273-6278.

［16］王晓凤，葛莲英，曹骥，等.FAF1在胃癌组织中的表达及其与凋亡的关系［J］.中华肿瘤防治杂志，2007，14(8):587-589.

［17］王健莉.FAF1、FLIP在胃癌中的表达及与Fas/FasL介导的免疫逃逸的相关性研究［D］.石家庄:河北医科大学，2007.

［18］Liu P，Zhang ZY，Luo XH，et al.Expression of Livin in human gastric carcinoma［J］.J Mod Oncol，2008，16(4):611-615.