益生菌干酪乳杆菌FM10-3产胞外多糖培养条件的优化

王英，周剑忠，黄开红，李清，刘小莉，赵延存

（江苏省农业科学研究院农产品加工研究所，南京210014）

0 引 言

乳酸菌胞外多糖（Exopolysaccharides,EPS）是乳酸菌生长代谢过程中分泌到细胞壁外的粘液多糖和荚膜多糖的总称[1-2]。乳酸菌是天然的食品工业中生产菌种，其产生的EPS具有对机体无毒副作用，来源安全可靠等优点，具有较高的安全性，近年来对乳酸菌的EPS的研究和开发引起广大研究者和食品加工业的重视[3-5],乳酸菌胞外多糖是天然的生物增稠剂，它可以替代其他目前在应用的、来源于非食品级微生物的稳定剂或增稠剂[6]。乳酸菌胞外多糖能提高酸乳的品质，能有效地保持凝胶结构，防止乳清析出[7-8]，另外，EPS具有增强免疫力，抗肿瘤，抗病毒等功效[9-10]，随着民众保健意识的增强，对具有保健功效的功能食品及保健品愈发收到重视。

FM10-3分离自新疆地区传统酸马奶中，鉴定为干酪乳杆菌[11]。前期对FM10-3的生物学及发酵特性进行了系统的研究[12]，本文对其产EPS的发酵条件进行研究，为将其开发成功能性乳制品的菌种资源提供又一重要依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)FM10-3，本实验室筛选保藏；MRS培养基按文献[13]中的方法配制，121℃灭菌20 min。10%的脱脂牛奶，巴氏灭菌。

葡萄糖，柠檬酸氢二铵，K2HPO4，Tween-80，Mg-SO4·7H2O，乙酸钠，苯酚，浓H2SO4，三氯乙酸，无水乙醇等，均为分析纯试剂；酵母提取物、牛肉浸出粉 、酪蛋白胨为生化试剂。

1.2 仪器与设备

恒温培养箱，生化培养箱，UV-1600PC型分光光度计，超净工作台，电热手提式高压杀菌锅，电子天平等。

1.3 方法

1.3.1 干酪乳杆菌的活化与扩大培养

将菌种的冻干粉分别接种到10%的灭菌脱脂牛奶管和液体MRS试管中，与37℃培养24 h，传代2次。按3%的接种量分别接种到装有10%的无菌的脱脂牛奶三角瓶和装有液体MRS的三角瓶中，培养24 h，置冰箱中备用。

1.3.2 胞外多糖的分离提取

胞外多糖的提取参照文献[14]和[15]并作适当改进。取10 mL发酵液液于离心管中，冷冻离心去除菌体。上清液分别用蛋白酶等处理以脱除蛋白，再添加3倍体积的冷乙醇于上清液中，4℃下静置过夜。冷冻离心得沉淀物，用冷乙醇洗涤沉淀物数次，再于90℃下干燥得胞外多糖粗提物。

1.3.3 胞外多糖的定量分析

采用苯酚一硫酸法[16]以葡萄糖作标准曲线，490 nm检测波长。同样的操作，取1 mL的样品液，测定490 nm吸收值，由标准曲线计算多糖含量。

1.3.4 产糖条件

具体方法参照文献[17]中方法，稍作修改。

（1）发酵温度对胞外多糖产量的影响 培养基起始pH值为6.8、接种量为5%、发酵时间为28 h的前提条件下，研究不同发酵温度(25，28，31，34，37，40 ℃)对合成胞外多糖产量的影响。

（2）发酵时间对胞外糖产量的影响 在产糖培养基起始pH为6.8、接种量为5%、发酵温度为37℃的前提条件下，研究不同发酵时间(12，16，20，24，28，32，36，40 h)对胞外多糖产量的影响。

（3）培养基起始pH对胞外多糖产量的影响 在接种量为5%、发酵温度为37℃、发酵时间为28 h的前提条件下，研究产糖培养基的不同起始pH值(5.5，6.0，6.5，7.0，7.5)对合成胞外多糖产量的影响。

（4）接种量对胞外多产量的影响 在产糖培养基起始pH为6.8、发酵温度为37℃、发酵时间为28 h的前提条件下，研究不同接种量（2%，3%，4%，5%，6%，7%)对胞外多糖产量的影响。

（5）胞外多糖发酵条件的优化。在单因素试验结果基础上，采用中心组合实验 Box-Behnken设计方案，以培养温度、接种量以及培养时间，分别用Xl，X2，X3来表示；并以+1，0，-1别代表变量的水平，按方程xi=(Xi—Xo)／△X 自变量进行编码。 式中，xi变量的编码值，Xi为变量的真实值，X0验中心点变量的真实值，△X为变量的变化步长，EPS质量浓度Y为响应值(表1)。

表1 中心组合试验Box-Behnken方案设计的因素和水平编码值

2 结果与分析

2.1 发酵温度对FM10-3 EPS产量的影响

微生物EPS的生成受培养温度的影响很大，培养温度的选择是提高EPS产量的一个重要条件。温度是影响细胞生长繁殖和EPS产量的重要因素之一，温度不同，菌株的生长及其EPS产量亦明显不同。培养温度过低，菌体生长缓慢，菌体浓度不高，从而影响次生代谢产物EPS的产量；培养温度过高，菌体培养后期易衰老进而自溶，菌体浓度亦不高，也会影响EPS的合成。FM10-3的EPS产量受培养温度的影响结果如图1所示，由图1可以看出，不同发酵温度条件下菌株FM10-3合成EPS的量不同，发酵温度在34℃时EPS产量处于最大值，低于34℃时随着温度的升高，EPS产量呈线性增加，但温度高于34℃时EPS产量开始下降，因此，菌株FM10-3合成胞外多糖的适宜温度是34℃。

图1 不同发酵温度对胞外多糖产量的影响

2.2 发酵时间对合成胞外多糖产量的影响

图2为发酵时间对FM10-3的EPS产量的影响结果。由图1可以看出，发酵时间长短对胞外多糖的产量影响较大。在不同的发酵时间菌株FM10-3合成EPS的量不同。发酵时间在28 h时EPS产量处于最大值。在发酵前期，EPS产量较低，这种现象说明在对数生长期由于培养基的营养物质较充足，而有利于菌体生长繁殖，却不利于胞外多糖的积累。发酵后期，菌体会分泌多糖降解酶而降低胞外多糖的产量。菌株FM10-3合成胞外多糖的适宜发酵时间28 h。

图2 不同发酵时间对胞外多糖产量的影响

2.3 pH值对合成胞外多糖产量的影响

培养基pH值高低对菌体生长繁殖与次生代谢产物胞外多糖的合成影响也很大，因为发酵液pH值的变化会影响发酵过程中多种酶的活性，当pH值抑制菌体中某些酶的活性时，会阻碍菌体的新陈代谢。pH值不同，引起菌体代谢过程不同，使代谢产物的产量和比例发生改变。许多研究证实，在接近中性偏酸的pH值条件下，EPS生物合成量较大[18]。由图3可以看出，在培养基不同起始pH值条件下菌株FM10-3合成EPS的量不同。培养基的起始pH值为6.5，即弱酸性条件时，使发酵液中胞外多糖产量达到最大值；培养基的pH值越接近中性偏碱条件，EPS产量越低，当pH值在超过7.5时胞外多糖产量较低；当培养基的pH值过低时，一方面分泌的多糖酶类有降解胞外多糖的作用[19]，另一方面pH值的降低会因失去脂质载体中间体而使胞外多糖的合成受阻[20]。综上所述，合成EPS的培养基适宜pH值为6.5。

图3 培养基初始pH值对胞外多糖产量的影响

2.4 接种量对合成胞外多糖产量的影响

图4为接种量对胞外多糖产量的影响。由图4可以看出，在试验设计的发酵时间内，不同的接种量菌株FM10-3合成EPS的量不同。接种量在5%时EPS产量处于最大值；接种量小于4%时EPS的产量处于较低水平；当接种量超过6%时EPS产量急剧下降。这是由于接种量过高，发酵前期会使菌体生长过快、菌体浓度过高，中后期会因营养物质消耗殆尽而导致合成胞外多糖的前体物质的减少，从而降低EPS的产量。综上所述，菌株FM10-3合成EPS的适宜接种量是5%。

图4 接种量的影响

2.5 响应曲面实验结果及分析

按表1列出的实验组合进行FM10-3培养后提取EPS，获得各种条件下EPS产量的提取值及其预测值，利用Design Expert软件，对响应值EPS产量的实验值进行二次多项回归拟合，建立EPS产量的回归模型,回归模型方程为

REPS产量=312.50+13.33X1+4.29X2+1.87X3+4.35X1X2+3.58X1X3-0.58X2X3-43.23X12-21.16X22-9.41X32。

对此模型进行方差分析结果如表3所示。由表3可以看出，模型在α=0.01水平上回归极显著（P＜0.001），模型的确定系数R2=0.9993,校正后的决定系数（R2）达到 0.9983，表明二次模型能很好地拟合不同培养条件下EPS产量的变化，失拟项不显著（P＞0.05），从另一角度说明该方程对数据进行了很好的拟合。

表2 Box-Behnken设计方案及实验结果

表3 回归模型方差分析

表4为回归方程系数显著性检验结果。由表4可以看出，模型一次项X1和X2极显著，X3显著；二次项X12，X22，X32均处于极显著水平；交互项X1X2极显著，X1X3处于显著水平、X2X3不显著。

利用Design Expert软件对表2数据进行二次多元回归拟合，所得到的二次回归方程的响应面及其等高线如图5～图7所示。

图6 pH值和温度对EPS产量影响的响应曲面和等高线

当pH值为6.5时，培养时间和培养温度对EPS产量的影响如图5所示。由图5可以看出，当培养时间不变，EPS产量会随着温度的增加而增加，当温度达到一定值后，EPS产量值呈现下降的趋势。当培养时间在25～28 h范围内，培养温度在31～34℃范围内，EPS产量值随着培养时间和培养温度的增加而增加，并最终达到最大值。

当培养时间为28 h时，pH值和培养温度对EPS产量的影响如图6所示。由图6可以看出，当pH值不变时，随着培养温度的增加，EPS产量呈现增加的趋势，当温度增加到一定值后，EPS产量值呈现下降的趋势。当pH值在6.2～6.5范围内，同时培养温度在31～34℃范围内，EPS产量值随着pH值和培养温度的增加而增加，并最终达到最大值。

图7 pH值和培养时间对EPS产量影响的响应曲面和等高线

当培养温度为34℃时，培养时间和pH值对EPS产量的影响如图7所示。由图7可以看出，当pH值不变时，随着培养时间的延长，EPS产量增加，当时间延长到一定值后，EPS产量值呈现下降的趋势。当培养时间在25～28 h范围内，pH值在6.2～6.5范围内，EPS产量值随着pH值和培养时间的增加而增加，并最终达到极大值。

2.6 优化组合及验证实验

当培养时间、温度和pH值范围分别设定在25～31 h，31～37℃和 6.2～6.8时，并将胞外多糖产量设定为最大值时，软件给出最优组合，即最后优化的产胞外多糖的最优条件为：培养温度为34.49℃，培养时间为28.35 h，pH值为6.54，此条件下EPS产量为313.973 mg/L。按实际可行设定情况，可设定培养温度为34.5℃，培养时间为28.4 h，pH值为6.5，作为产EPS的最佳培养条件。为了进一步验证产EPS的最优的培养条件，采用上述条件进行了3次重复试验，结果EPS产量在 （313.36±1.35）mg/L，与理论值 313.97 mg/L基本一致。

3 结 论

通过单因素试验分析干酪乳杆菌FM10-3产EPS的主要影响因素，采用Box-Behnken的中心组合设计及响应面分析，建立干酪乳杆菌FM10-3产EPS二次多项式数学模型。获得到干酪乳杆菌FM10-3产EPS最佳培养条件为：培养温度为34.5℃，培养时间为28.4 h，pH值为6.5，在此条件下FM10-3的胞外多糖产量为313.36mg/L。经检验证明该模型是合理可靠的，能够较好地预测干酪乳杆菌FM10-3产EPS的量。

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