海州湾条斑紫菜养殖对浮游藻类群落结构及遗传多样性的影响

王洪斌 , 李信书 宋秀梅 吴 言 李士虎 阎斌伦

(1.淮海工学院 海洋学院, 江苏 连云港 222005; 2.江苏省海洋生物技术重点实验室, 江苏连云港 222005)

在水生态系统中, 浮游藻类是海洋生态系统初级生产力代表, 也是海洋生态系统中食物链的重要环节,其种类组成、数量变化往往也是所处环境综合作用的结果, 浮游藻类对外部环境因子的变化非常敏感[1]。因此, 浮游藻类群落组成的改变能在一定程度上反映水环境的状态。目前, 越来越多的研究开始关注浮游藻类与环境因子之间的关系[2]。核酮糖1, 5-二磷酸羧化/氧化酶( RubisCO)是浮游藻类光合作用的关键酶,具有催化 CO2还原和 1, 5-二磷酸核酮糖氧化的双重功能, 广泛存在于藻类和高等植物中[3]。RubisCO 大亚基基因(rbcL) 是研究物种间系统学关系比较恰当的标志基因,rbcL基因没有内含子结构, 可以直接PCR, 广泛应用于浮游藻类系统学及多样性研究[4]。

海州湾位于江苏省北部连云港沿海, 近年来,由于城市化进程的快速发展, 大量含有高浓度氮、磷等营养物的污染物排入沿海, 使得近海的富营养化问题十分严重, 赤潮频繁发生[5]。以往也有不少学者,对海州湾的理化因子与浮游植物的数量变化关系进行了研究[6], 并发现浮游植物的数量变化与环境因素的变化密切相关。而针对条斑紫菜养殖行为导致水质条件改变, 从而引起浮游藻类群落结构及组成的变化研究未见报道。

作者分别提取了江苏海州湾条斑紫菜非养殖区及养殖区的浮游藻类总DNA, PCR方法扩增浮游藻类rbcL片段, 构建了条斑紫菜非养殖区及养殖区浮游藻类rbcL片段质粒文库, 根据rbcL序列分析, 研究了海州湾条斑紫菜养殖对浮游藻类遗传多样性及群落结构的研究。

1 材料与方法

1.1 实验样品来源及试剂

2012年12 月, 于江苏省海州湾近海条斑紫菜非养殖海区(1、3、5、7 )和养殖海区( 2、4、6、8 )采集表层海水, 共 8个样点 (图1)。于每个样点(距水面0.2~0.3 m处)取200 mL表层水, 分装在已灭菌的PVC瓶中, 所取水样置于保温箱中立刻运往实验室,于4℃黑暗保存, 且所有样品都在一周内进行分析。

PCR引物合成、测序由上海桑尼生物科技有限公司完成; pMD18-T载体购自宝生物(大连)工程有限公司;Escherichia coliJF1125由本实验室保存; 其他分子生物学试剂均为分析纯。

图1 采样点位置示意图Fig.1 Map of sampling sites

1.2 海水中浮游藻类总DNA的提取

养殖海区(2、4、6、8)各采样点分别取水样100 mL混匀, 非养殖海区水样处理同养殖区。400 mL冷藏水样10 000 r/min、离心10 min, 弃上清, 沉淀中加入460 μL裂解缓冲液(250 mmoL Tris-HCl pH 8.0,60 mmoL EDTA), 340 μL 10%SDS, 蛋白酶 K(终质量浓度 0.2 mg/mL)15 μL, 37 ℃温浴 3 h, 10 000 r/min、离心10 min, 上清转至洁净1.5 mL离心管, 等体积酚氯仿抽提, 12 000 r/min、离心1 min, 上清液用2倍体积的异丙醇4 ℃沉淀过夜, 12 000 r/min、离心10 min, 弃上清, 沉淀用50 μL TE缓冲液溶解, -20 ℃保存[7]。

1.3 PCR扩增rbcL基因及rbcL质粒文库构建

以海水浮游藻类总DN A为模板, PCR法扩增获得海洋浮游藻类rbcL片段。根据Ⅰ型 RubisCO 大亚基氨基酸保守区( KPKLGLS 和 VVGKLEG)[8]设计PCR 引物。引物序列分别为5′-AA(AG)CC(TA)AA(AG)(TC)TAGG(TG)(CT)T(AT)TC-3′和 5′-CC(TC)TC(TC)A(AG)(TC) TTACC(AT)AC(GAT)AC-3′。PCR 反应体系: 模板DNA为50 ng(1.5 μL), dNTP为0.2 mmol ,正反向引物各为 0.2 μmol, Taq 酶 2 unit, buffer 5 μL,50 μL反应体系[9]。 PCR反应条件: 95 ℃预变性5 min,94 ℃变性1 min, 48 ℃复性2 min, 72 ℃延伸1 min,72 ℃终止延伸10 min, 35循环。PCR 产物割胶回收,与pMD18-T载体( TaKaRa公司)连接, 转化感受态细胞E.coliJF1125, 获得rbcL片段质粒文库。随机挑选重组子, 抽提质粒, 由上海桑尼生物科技有限公司完成测序。经序列比对并用邻接法构建系统进化树[10]。

2 结果与分析

2.1 条斑紫菜养殖对浮游藻类群落结构的影响

PCR产物约300bp, 构建浮游藻类rbcL片段质粒文库(养殖区 DrbcL, 非养殖区 CrbcL)。文库中随机选择 50个阳性克隆, 测定序列, 并用邻接法构建系统进化树(图2, 图3), 根据序列比对及进化树显示的遗传距离分析确定养殖及非养殖海区的浮游藻类的群落结构组成。本研究使用的PCR引物是Ⅰ型rbcL基因特异的, 而甲藻rbcL基因属于Ⅱ型[9]。因此, 本研究使用的引物无法扩增甲藻rbcL基因。结果显示, 非养殖区发现8种海洋微藻, 分别为隐鞭藻(Cryptomonas)、异弯藻(Heterosigma)、塔胞藻(Pyramimonas mantoriae chicroplast)、全沟藻(Teleaulax amphioxeia)、筒柱藻(Cylindrotheca)、小球藻(Chlorella)、海链藻(Thalassiosira)、骨条藻(Skeletonema)。养殖区发现 10种海洋微藻, 分别为异丝藻(Heterothrix debilis)、杜氏藻(Dunaliella)、 隐鞭藻(Cryptomonas)、骨条藻(Skeletonema)、小球藻(Chlorella)、菱形藻(Nitzschia longissima)、嚎壳藻(Ostreobium quekettii)、链带藻(Desmodesmus pseudoserratus)、小环藻(Cyclotella)、拟伊藻(Ahnfeltiopsis leptophylla)。海洋中浮游藻类种类繁多, 影响其种类及丰度的主要因素为浮游藻类自身消长的特性、水体条件及浮游动物等的捕食。浮游藻类的丰度及组成受紫菜养殖的影响, 如骨条藻在养殖区为优势种群, 但在非养殖区却变为劣势种群。养殖区和非养殖区虽然只随机抽取了50个序列, 但是这些序列至少覆盖了一个优势种群, 如养殖区的异丝藻及非养殖区的隐鞭藻。隐鞭藻和小球藻为两海区所共有的优势类群且覆盖克隆数比例均较高, 说明小球藻与隐鞭藻的适应性强。因紫菜养殖和非养殖区相距较近,海水随潮汐和风浪而流动, 所以紫菜养殖和非养殖区的物化及环境生态因子既有差异也有相同之处。已有实验证实, 紫菜养殖和非养殖区因紫菜光合作用导致营养盐存在显著性差异[11-12], 这种差异势必对浮游藻类群落结构产生影响。

2.2 条斑紫菜养殖对浮游藻类遗传多样性的影响

条斑紫菜养殖及非养殖海区浮游藻类类群覆盖克隆数见表1。依据覆盖克隆数的百分比, 非养殖区8种海洋微藻为隐鞭藻(22%)、异弯藻(18%)、塔胞藻(14%)、全沟藻(13%)、筒柱藻(12%), 小球藻(12%),海链藻(6%), 骨条藻(2%), 见图2。隐鞭藻、异弯藻在非养殖区所占比例较大, 含量丰富; 海链藻, 骨条藻多占比例较小。养殖区 10种海洋微藻为异丝藻(22%)、杜氏藻(12%)、 隐鞭藻(12%)、骨条藻(12%)、小球藻(10%)、菱形藻(8%)、嚎壳藻(6%)、链带藻(6%)、小环藻(6%)、拟伊藻(2%), 见图3。异丝藻在养殖区所占比例较大, 优势度明显; 链带藻, 菱形藻等类群占比例差不多, 为6%~12%。如果将覆盖克隆数大于5(10%) 的类群定义为优势类型, 那么非养殖区的优势类群有隐鞭藻(22%), 异弯藻(18%), 塔胞藻(14%)全沟藻(13%), 小球藻(12%), 筒柱藻(12%),养殖区的优势类群有异丝藻(22%), 杜氏藻(12%),骨条藻(12%), 隐鞭藻(12%), 小球藻(10%)。优势类群的形成不仅仅决定于营养、温度等环境条件, 还与物种生理特性相关, 物种间竞争也会影响到优势物种的形成[13]。15种浮游藻类类群中只有 3种(隐鞭藻, 骨条藻及小球藻)为两海区共有, 其他浮游藻类类群均为不同区域所有, 证实条斑紫菜养殖区及非养殖区浮游藻类群落组成差异显著。杜氏藻、异丝藻为养殖区所特有的, 异丝藻含量极高, 养殖区内的其他几类浮游藻类类群的含量接近, 异弯藻,全沟藻, 塔胞藻, 属于非养殖区特有优势类群。两海区共有的浮游藻类类群中骨条藻的丰度差异极大,在非养殖区所占比例极小; 小球藻与隐鞭藻在两个区域中的丰富度都较高, 可能由于隐鞭藻和小球藻对温度、营养条件及其他物化因子具有较强的适应能力, 广泛存在于各个区域, 并且形成优势类群。而非共有的 12个浮游藻类类群对环境因子需求较高,适应力较窄, 只有在特定水体条件下才能够大量繁殖, 如异丝藻只在紫菜养殖区大量存在, 非养殖区没有, 表明条斑紫菜养殖区的水体环境等因素适宜此类浮游藻类生长繁殖, 当生长条件适宜的时候, 具有竞争优势的物种将快速繁殖, 大量的利用营养物质,抑制其他藻类的生长而迅速成为优势种群。至于异丝藻与条斑紫菜养殖耦合的生态条件有待进一步研究。

图2 非养殖区浮游藻类进化树Fig.2 System evolution tree of phytoplankton in natural region

图3 养殖区浮游藻类进化树Fig.3 System evolution tree of phytoplankton in mariculture zone

表1 海州湾养殖和非养殖海区浮游藻类分布Tab.1 Distribution of Phytoplankton in mariculture zone and natural region in Haizhou bay

2.3 条斑紫菜养殖对浮游藻类丰度的影响

物种多样性指的是群落中物种数目的多少, 它是衡量群落的规模和重要性的基础, 而以往研究多侧重于营养盐浓度对浮游植物的上行效应, 近年来,随着研究深入, 浮游植物多样性对营养盐结构变化的响应也引起了国内外学者的广泛关注[14-15]。表2显示, 非养殖区的香农指数小于 3的浮游藻类类群,占了总类群的 50%, 而养殖区的香农指数小于 3的只占1个, 占了总类群的10%, 养殖及非养殖海区的香农指数均值为 3.654/3.273, 养殖区的浮游藻类香农指数普遍高于非养殖区, 养殖区生物多样性丰富,与上述结论一致。其原因可能是条斑紫菜养殖行为导致本海区的物化及其他环境生态改变, 特别是N/P的变化, 营养盐结构改变会导致浮游植物群落结构发生变化, 影响到海洋生态系统的多样性和稳定性[16]。非养殖区的均匀度指数差异较大, 养殖区的均匀度指数差异较小, 养殖区平均均匀度为 1.040,非养殖区的平均均匀度为 1.090, 养殖区的平均均匀度指数小于非养殖区, 可见非养殖区的浮游藻类的物种分布较为均匀, 群落的成熟度与稳定性比养殖区高。说明不同种类浮游植物的营养盐利用方式及生长势的差异是影响其群落竞争格局的关键因素[17],非养殖区因无条斑紫菜存在, 海区物化及各种环境因子较稳定, 浮游藻类群落的稳定性较高。

3 结论

作者运用PCR法扩增浮游藻类核酮糖1, 5-二磷酸羧化/氧化酶大亚基(rbcL) 基因片段, 构建了条斑紫菜养殖及非养殖海区浮游藻类的rbcL片段质粒文库。随机选择文库50个克隆并测序, 经比对分析,条斑紫菜非养殖区发现 8种海洋微藻, 分别为隐鞭藻、异弯藻、塔胞藻、全沟藻、筒柱藻, 小球藻, 海链藻, 骨条藻。养殖区共发现 10种海洋微藻, 分别为: 异丝藻、杜氏藻、 隐鞭藻、骨条藻、小球藻、菱形藻、嚎壳藻、链带藻、小环藻、拟伊藻。

浮游藻类类群中只有 3种(隐鞭藻, 骨条藻及小球藻)为两个海区共有, 其他浮游藻类类群均为不同海区所有, 证实条斑紫菜养殖及非养殖海区浮游藻类群落组成差异显著。杜氏藻、异丝藻为养殖区所特有的, 异丝藻优势极高, 养殖区内的其他几类浮游藻类类群的含量接近; 异弯藻, 全沟藻, 塔胞藻,属于非养殖区特有优势类群。

表2 海州湾养殖和非养殖区浮游藻类多样性Tab.2 Genetic diversity of Phytoplankton in mariculture zone and natural region in Haizhou bay

实验证实, 条斑紫菜养殖海区浮游藻类遗传多样性丰富, 而群落的成熟度与稳定性以非养殖区为高。说明表层海水浮游藻类群落结构及组成是动态的, 条斑紫菜的养殖改变了浮游藻类群落结构及遗传多样性。养殖海区浮游藻类的多样性及丰富度高于非养殖海区, 而且养殖海区出现的优势藻类均为海州湾非赤潮优势藻[18], 多样性丰富降低了单一海洋微藻因富营养化而导致的爆发性增长的可能, 减少赤潮发生的频率。浮游藻类群落结构及遗传多样性改变对于条斑紫菜养殖行为使海域生态环境的修复具有重要意义。

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