大黄鱼β-actin抗体的制备与组织表达谱分析

董 乐, 姚丽梅, 戴聪杰, 张 乐, 黄苹苹, 王建颖

(泉州师范学院 化学与生命科学学院, 近海资源生物技术福建省高校重点实验室, 福建 泉州 362000)

肌动蛋白(Actin)是构成细胞骨架的主要成分[1],几乎参与了真核细胞的所有生理过程, 如细胞分裂、染色体运动、细胞器运动、细胞激化、胞质流动、基因转录调控、mRNA 加工和运输等[2-4]。肌动蛋白有6 种异构体, 根据等电点的不同分为α、β、γ 3类:两个横纹肌(α-骨骼肌型, α-心肌型), 两个平滑肌(α-血管平滑肌型, γ-内脏平滑肌型), 两个细胞质型(β和γ亚型)[5]。其中, β-actin 除具氨基酸序列高度保守性外, 还能在不同的组织中持续衡量的表达, 且其表达量高, 因此在研究某个基因 mRNA及蛋白质的相对表达量时, 常分别采用 β-actin 基因的 mRNA 和β-actin作为内标[6-9]。但近年来也有研究表明, β-actin基因有时也会受到生理状态或者环境的调控而出现表达水平的差异[10-12]。因此, 在采用 β-actin及其基因作为分子内标开展实验研究时, 必须首先评价其在该物种中的表达特征。

迄今, 鲢(Hypophthalmichthys molitrix)、真鲷(Pagrosomus major)、斑马鱼(Danio rerio)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)、(Elopichthys bambusa)、尖头(Phoxinus oxycephalusSauvage et Dabry)、团头鲂(Megalobrama amblycephala)、鲤(Cyprinus carpio)、草鱼(Ctenopharyngodon idella)、斜带石斑鱼(Epinephelusco joides)、大西洋鲑(Salmo salar)、罗非鱼(Oreo-chromis mossambicus)、松江鲈(Trachidermus fasciatus)等硬骨鱼类的 β-actin基因已被克隆[13-14]。大黄鱼(Larimichthys crocea)系鲈形目(Perciformes)、石首鱼科(Sciaenidae)、黄鱼属(Pseudosciaena), 是中国海洋主要经济鱼类之一[15]。对大黄鱼功能基因的挖掘与利用的研究极为重要。大黄鱼 β-actin基因(LcActb)全长cDNA序列已被提交GenBank(GU 584189.1;FJ936563.1), 但其在转录和翻译水平上组织表达谱的研究尚未见报道。

本研究采用RT-PCR技术克隆LcActb的开放阅读框(Open reading frame, ORF), 同时, 将其亚克隆到原核表达载体上进行表达, 并制备和纯化抗LcActb的多克隆抗体, 通过实时荧光定量PCR(qRTPCR)和Western blotting方法, 分析LcActb在肌肉、心脏、肝脏等 8 个组织中的表达模式, 为探讨其作为内参基因进行相关研究的可行性, 也为进一步研究大黄鱼功能基因的差异表达提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料

成熟大黄鱼 (全长 410~450 mm)活体购于福建省宁德市海洋技术开发有限公司, 解剖后, 取其心脏、肝、脾、肠、胃、肾、肌肉和幽门垂共8 种组织,立即冻存于液氮中, 带回实验室后转入-80℃冰箱保存备用。雌、雄鱼各取 5 尾, 用于提取克隆LcActb的ORF序列和分析LcActb组织表达所需的总RNA。

1.2 方法

1.2.1 PCR扩增LcActb的ORF序列

以常规 Trizol 法提取各组织的总 RNA后, 按Invitrogen公司的试剂盒说明书进行 mRNA的纯化和cDNA第一链的合成。以合成的肝脏cDNA第一链为模板, 根据已克隆的LcActb全长 cDNA序列(GenBank accession: GU584189.1; FJ936563.1)设计 1对特异性引物, 以此进行 PCR扩增得到LcActb的ORF序列, 引物序列如下;

P1: 5′- CCCAAGCTT(Hind III识别位点)ATGG AAGATGAAATCGCCGC;

P2: 5′- CCGCTCGAG(XhoI识别位点)TTAGAA GCATTTGCGTTTGCGGTGGAC,

引物由上海生工生物技术工程服务有限公司合成。

PCR 反应体系为 50 μL, 其中包括 10 mmol/L Tris-HCl (pH8.3)、50 mmol/L KCl、1.5 mmol/L MgCl2、1 mmol/L dNTPs、10-4mmol/L P1、10-4mmol/L P2、1 unit Taq DNA polymerase。反应条件为94 ℃预变性5 min; 94 ℃变性1 min, 50 ℃退火1 min, 72 ℃延伸1 min,循环数35 个; 72 ℃再延伸10 min。

1.2.2LcActb原核表达载体的构建

按文献[16]进行; DNA测序由上海生工生物技术工程服务有限公司进行;LcActb的 ORF序列分析用DNA Strider 1.2。

1.2.3 pET32a-LcActb在大肠杆菌中的表达及可溶性分析

重组质粒转化E.coliBL21, 挑取阳性单菌落,活化后进行诱导表达, 同时设未诱导对照。其中,IPTG 分别设置为 0.1、0.2、0.4、0.6、0.7、0.8 mmol/L,诱导温度分别设置为18、24、28、34、37 ℃, 诱导时间分别设置为 2、3、4、5、6、7 h。重组表达蛋白可溶性分析按文献[16]进行。用SDS-PAGE电泳检测表达产物, 分离胶浓度为12%。

1.2.4 LcActb的纯化

重组菌按上述探索好的条件大量表达。LcActb的纯化按QIAGEN公司Ni-NIA Agarose试剂盒说明书进行, 并用SDS-PAGE 鉴定蛋白纯度。

1.2.5 LcActb抗血清的制备及效价检测

按文献[17]进行。

1.2.6 LcActb抗血清IgG的纯化

按文献[18]进行。

1.2.7 Western Blotting 分析

按文献[16]进行。其中, 鼠抗His单克隆抗体作为一抗(1: 3000), 辣根过氧化物酶( HRP) 标记的羊抗鼠IgG 为二抗(1: 4000), 用ECL发光试剂盒曝光充分显色, 拍片保存。

1.2.8LcActb在大黄鱼各组织的表达

分别提取心脏、肝、脾、肠、胃、肾、肌肉和幽门垂共8 种组织的RNA后, 进行qRT- PCR。引物序列如下,

qAct1: ACGCCAACACCGTGCTGTC;

qAct2: TTAGAAGCATTTGCGGTGGAC,

引物由上海生工生物技术工程服务有限公司合成。

qRT- PCR 反应体系为 15 μL: Mix 7.5 μL, qAct1 0.15 μL; qAct2 0.15 μL; cDNA 1.5 μL; RNase Free ddH2O 补至 15 μL。

于 StepOnePlus™实时荧光定量 PCR 系统上扩增, 程序为: 50 ℃ , 2 min; 95 ℃ , 10 min; 95 ℃ , 15 s,60 ℃ , 1 min,循环数40 个。PCR 扩增产物先用1%琼脂糖凝胶电泳检测。LcActbmRNA相对表达水平用 2–ΔΔCT法计算[19]。每个样品重复 3 次。以肝脏的表达水平作对照, 目的基因相对表达量用平均值±标准差表示, 数据分析采用 SPSS17.0统计分析软件,Duncan法进行多重比较, 当P<0.05 时差异显著。

1.2.9 LcActb在大黄鱼各组织的表达

从心脏、肝、脾、肠、胃、肾、肌肉和幽门垂共 8 种组织中提取总蛋白。采用 Bradford 方法[20]定量蛋白质后, 每个组织取 1 mg 蛋白质进行SDS-PAGE分析, 分离胶浓度为 12%。经 Western Blotting检测 LcActb 在大黄鱼各组织中的表达情况。实验经3 次生物学重复。

2 结果与分析

2.1 pET32a-LcActb的构建及鉴定

LcActbORF的PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后, 将预期大小的 PCR产物与 pET32a(+)载体用T4DNA 连接酶连接。连接产物转化E.coliDH5α,经选择性培养基筛选和双酶切鉴定, 挑选阳性重组质粒进行测序。测序结果表明(图1), 该片段长1128 bp,编码375个氨基酸残基组成的肽段。序列分析表明, 该片段序列与原序列一致, 阅读框架正确, 目的基因插入正确, 显示重组表达载体pET32a-LcActb构建成功。

图1 LcActb的ORF序列和推断的氨基酸序列Fig.1 The cDNA and predict amino acid sequences of the LcActb ORF in L.crocea

2.2 LcActb蛋白原核表达、可溶性分析及纯化

pET32a-LcActb重组菌经菌落 PCR检测后, 随机挑取 1个阳性菌, 加 IPTG 诱导表达。pET32a-LcActb诱导表达量随温度升高而增多, 至 28 ℃时,其表达量达最高后, 又随温度升高而减少。故选择诱导温度为 28 ℃, 结果见图2A。由于目的蛋白为41.701 ku, 加上质粒 pET-32a(+)在多克隆位点上游有一段编码序列, 融合蛋白约为45~47 ku。实验结果与预期的目的蛋白大小相符。不同时间诱导时, 诱导5 h 后诱导表达量增多, 故选择诱导时间为 5 h, 结果见图2B; 不同 IPTG 浓度诱导时, IPTG 浓度从0.1 mmol/L 到0.8 mmol/L 诱导时, 表达量最大时的IPTG 浓度为0.4 mmol/L, 结果见图2C; 用IPTG 浓度为0.4 mmol/L 诱导表达的BL21 重组菌经离心收集菌体, 菌体经超声波裂解, 用 SDS-PAGE 分析裂解后的上清和沉淀, pET32a-LcActb表达蛋白存在菌体裂解液沉淀中, 即以包涵体形式表达, 结果见图2D。

纯化的LcActb用SDS-PAGE进行分析, 结果只含有一条目的蛋白带(图3A)。蛋白浓度为1.67 g/L。经 Western blotting 验证, 泳道上出现蛋白特异性的反应条带(图3B)。实验结果表明, LcActb表达成功。

2.3 抗LcActb抗血清制备及其效价检测和特异性分析

以纯化LcActb为抗原制备抗血清。以未免疫的兔血清作为阴性对照, 将免疫的兔抗血清做不同稀释后, 进行 ELISA检测。标本孔的吸收值与阴性标本孔的吸收值的比值(P/N)大于 2.1时判断为阳性。结果表明, LcActb的兔抗血清效价达到1 ∶ 1.00×106。

图2 pET32a-LcActb原核表达条件的优化及可溶性分析SDS-PAGE图谱Fig.2 SDS-PAGE analysis of optimized expression condition and the protein solubility of pET32a-LcActb in E. coli

图3 LcActb蛋白纯化的 SDS-PAGE图谱和 Western blotting 验证Fig.3 SDS-PAGE and Western blotting analysis of purified LcActb

Western blotting结果显示, 用免疫前的血清进行实验时不显示条带; 未纯化的抗血清由于含有很多非特异性抗体, 所以有非特异性条带; 而用纯化的LcActb特异性的抗体(1: 1000 稀释), 则无非特异性条带(图4)。以上结果表明, 制备和纯化后的LcActb 多克隆抗体特异性较强。

2.4 LcActb基因在大黄鱼各组织的表达

利用qRT- PCR方法分析LcActb在大黄鱼心脏、肝、脾、肠、胃、肾、肌肉和幽门垂共8 种组织的表达及差异, 结果显示,LcActb在这些组织中均有表达。

应用2–ΔΔCT法计算LcActb在各组织中的表达量,以肝的表达量为 1 计算,LcActb在各组织的表达量无显著性差异(图5)。

利用Wester blotting 方法分析LcActb在大黄鱼上述8 种组织的表达及差异, 结果显示(图6), LcActb在这些组织中含量无显著差异。

图4 纯化的多克隆抗体的Western blotting特异性分析Fig.4 Western blotting analysis of purified LcActb antibody

图5 LcActb在不同组织中的表达量Fig.5 Expression pattern of LcActb in different tissues of L.crocea

图6 LcActb在不同组织中的含量Fig.6 Expression pattern of LcActb in different tissues of L.crocea

3 讨论

一直以来, 在分子生物学领域的基因 mRNA的相对表达研究中, 由于β-actin具有时空恒定表达的特性而成为最常用的内参基因。但近年来有研究认为,β-actin在有些物种、某些情况下并不适合作为内参基因。其一,β-actin表达水平在不同的外界环境或生理条件下可能存在显著的差异[20-21], 如广温性鲤(Cyprinus carpio)冷适应机制的研究表明,β-actin的表达水平在冬季和夏季存在显著性差异[22]。其二,β-actin基因的表达水平在生物不同的生长阶段也有所不同[23], 如斑马鱼 β-actin基因表达量在脑神经细胞增殖时过表达[24]。其三, β-actin 基因受某些疾病的影响表达量也有所不同, 如在哮喘患者气道中β-actin基因的表达水平比正常组织中的表达水平低10倍[11]。这说明, 在利用β-actin作为内参进行基因表达研究时, 首先要对其作为分子内参的可靠性进行评估。

本研究通过qRT-PCR 检测得到的结果表明, 大黄鱼LcActb的mRNA 在所采集的成体鱼心脏、肝、脾、肠、胃、肾、肌肉和幽门垂共 8种组织中的表达差异均不显著。这与宽体沙鳅(Botia reevesae)[13]、鳡(Elopichthys bambusa)[14]、三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)[25]、黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)[26]中的研究结果基本一致。但迄今, 关于鱼类β-actin表达的研究都没有从不同的发育阶段及外界环境或生理条件对其影响等方面进行系统的展开, 基本上仅限于基因在某一时期不同组织中的表达差异方面进行分析。本研究只研究了成体鱼不同组织中LcActb的表达情况, 至于,LcActb表达水平在不同的生长阶段、在不同的外界环境或生理条件下是否存在差异,将是我们下一步要深入研究的问题。因此,LcActb可作为研究大黄鱼成体鱼中其他基因表达转录水平时的内参标准。

mRNA 的相对量说明了β-actin在转录水平是否存在差异; 蛋白质的相对量能进一步表明β-actin在转录后水平的差异。现有文献也基本上只针对于前一个方面开展研究。本研究进一步分析了LcActb在转录后的蛋白质水平的差异。Western blotting检测的结果表明,LcActb在转录后水平也无差异, 即LcActb在8 种组织中表达量恒定。因此,LcActb可作为研究大黄鱼成体鱼中其他基因表达转录后水平的内参标准。

[1]Ma H M, Mai K S, LiuFu Z G.Cloning and characterization of an actin gene ofChlamys farreriand the phylogenetic analysis of mollusk actins[J].Chin J Oceanol Limnol, 2007, 25(3): 304-309.

[2]Pederson T.Half a century of “the nuclear matrix” [J].MolBiol Cell, 2000, 11(3): 799-805.

[3]Tamura K, Dudley J, Nei M, et al.MEGA 4: Molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) softwareversion 4.0[J].Mol Biol Evol, 2007, 24(8): 1596-1599.

[4]Wang Z L, Wu Z H, Jian J C, et al.Cloning and expression of an actin gene in the haemocytes of pearl oyster (Pinctada fucata, Gould 1850) [J].Mar Genom,2008, 1(2): 63-67.

[5]Venkatesh B, Tay B H, Elgar G, et al.Isolation, characterization and evolution of nine pufferfish(Fugu rubripes)actin genes[J].J MolBiol, 1996, 259(4): 655-665.

[6]Zhong H, Jonathan W S.Direct comparison of GAPDH,β-actin, cyclophilin, and 28S rRNA as internal standards for quantifying RNA levels under hypoxia[J].Biochem Biophys Res Commun, 1999, 259(3) : 523-526.

[7]夏来新, 程汉华, 郭一清, 等.黄鳝 β-actin 的克隆及其在鱼类中的系统发生分析[J].遗传学报, 2005,32(7) : 689-695.

[8]Nicot N, Hausman J F, Hoffmann L, et al.Housekeeping gene selection for real-time RT-PCR normalization in potato during biotic and abiotic stress[J].J Exp Bot, 2005, 56( 421) : 2907-2914.

[9]Isabel C, Francisco V S, Frederick S B, et al.Isolation of the Atlantic salmon β-actin promoter and its use to drive expression in salmon cells in culture and in transgenic zebrafish[J].Aquaculture, 2010, 309(1-4):75-81.

[10]段晶晶, 李霞, 周伯文, 等.仿刺参 beta-actin 基因的克隆及在各组织中的表达[J].大连水产学院学报,2009, 24(2): 176-180.

[11]Glare E M, Divjak M, Bailey M J, et al.beta-actin and GAPDH house keeping gene expression in asthmatic airways is variable and notsuitable for normalising mRNA levels[J].Thorax, 2002, 57(9): 765-770.

[12]Ruan W J, Lai M D.Actin, a reliable marker of internal control[J].Clin Chim Acta, 2007, 385 (1-2): 1-5.

[13]覃川杰, 陈立侨, 岳兴建, 等.宽体沙鳅(Botia reevesae)β-肌动蛋白基因的 cDNA 克隆与表达分析[J].海洋与湖沼, 2013, 44(2): 396-402.

[14]郁建锋, 王蕾, 张燕萍, 等.鳡 β-肌动蛋白基因的克隆及表达分析[J].常熟理工学院学报(自然科学),2011, 25(4): 65-70.

[15]张彩兰, 刘家富, 李雅璀, 等.福建省大黄鱼养殖现状分析与对策[J].上海水产大学学报, 2002, 11(1) :77-83.

[16]萨姆布鲁克J, 拉塞尔 D W.分子克隆实验指南[M].黄培堂等, 译.第 3版.北京: 科学出版社, 2002:1217-1232.

[17]杨琴, 曹军皓, 丁进亚, 等.转位紧密黏附素受体细胞骨架偶联蛋白基因克隆、表达、抗体制备及应用[J].细胞与分子免疫学杂志, 2012, 28(12): 1282-1285.

[18]Zhao Q G, Zhou Y, Zhu H Q, et al.Generation of mouse FANCL antibody and analysis of FANCL protein expression profile in mouse tissues[J].Acta Genetica Sin, 2006, 33(1): 49-55.

[19]Livak K J, Schmittgen T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCTMethod[J].Methods, 2001, 25(4): 402-408.

[20]Bradford M M.A rapid and sensitive method of or the quantitation of microgram quantitative of protein using the principle of protein - dye binding[J].Anal Biochem,1976, 72: 248-254.

[21]梁赞姜, 汲坤, 王立军.大鼠不同脏器 beta-actin mRNA稳定性差异的实验研究[J].锦州医学院学报,2006, 6(3): 11-13.

[22]Sarmiento J, Leal S, Quezada C, et al.Environmental acclimatization of the carp modulates the transcription of beta-actin [J].J Cell Biochem, 2000, 80(2): 223-228.

[23]Moshier J A, Cornell T, Majumdar A P.Expression of protease genes in the gastric mucosa during aging [J].Exp Gerontol, 1993, 28(3): 249-258.

[24]Alejandro B, Rogelio G S, María G I, et al.Differential brain expression of a new beta-actin gene from zebrafish (Danio rerio) [J].Eur J Neurosci, 1999, 11(1):369-372.

[25]袁一鸣, 李家乐, 汪桂玲, 等.三角帆蚌β-肌动蛋白基因的 cDNA 全长克隆及表达分析[J].水产学报,2010, 34(6): 871-879.

[26]宋伟, 王晓琳, 严维辉, 等.黄颡鱼β-肌动蛋白基因的克隆及表达分析[J].江苏农业学报, 2008, 24(3):263-267.