NaHCO3碱度对5 种幼鱼的生存及鳃、肾组织的影响

杨 建，徐 伟，耿龙武，关海红，党云飞，李晨宇

(1.中国水产科学研究院 黑龙江水产研究所，黑龙江 哈尔滨 150070;2.上海海洋大学 水产与生命学院，上海 201306)

我国约有6.9×108hm2低洼盐碱水域，约占全国湖泊总面积的55%［1］。这些水资源的主要特点是盐碱度高，缓冲能力差［2］，生物资源贫乏，渔业产量一直处于较低水平。因此，掌握不同鱼类对盐碱的耐受性及调控机制，对开发和利用这些水域具有重要的意义。近年来，针对盐度对鱼类的受精孵化率、生长发育、组织结构和酶活力影响等进行了较多研究［3-5］，但碱度对鱼类的影响报道则相对较少。

2003 年黑龙江水产研究所从乌兹别斯坦外引进了耐盐碱鱼类大鳞鲃(Barbus capito)，该鱼属鲤科，鲃亚科，鲃属，溯河洄游性鱼类，具有食性广、生长速度快、肉质鲜美、耐盐碱、适应性强等特点［6］。目前，大鳞鲃的人工繁育已获得成功［7］，为大鳞鲃的推广奠定了基础。目前，我国低洼盐碱水域面临着养殖品种单一，生产效益不高等难题［2］，急需引入新的耐盐碱鱼类品种，本研究比较了大鳞鲃与草鱼(Ctenopharyngodon idllus)、镜鲤(Songpu mirror carp)、鲫鱼(Carassius auratus)和白鲢(Hypophthalmichthys molitrix)等几种常见池塘养殖鱼类在NaHCO3碱度胁迫下的耐受性能及其对组织影响，以期为盐碱水域的渔业开发利用提供参考。本研究利用NaHCO3溶液对大鳞鲃、草鱼、镜鲤、鲫鱼和白鲢进行碱度急性毒性试验，比较5 种幼鱼对碱度的耐受性，并通过鳃、肾组织的病理切片观察，探索鱼类在高碱胁迫下不同鱼类组织结构的变化。

1 材料与方法

1.1 试验材料

大鳞鲃、草鱼、镜鲤、鲫鱼和白鲢均为黑龙江水产研究所呼兰试验站培育50 d 左右的健康幼鱼。试验前在室内停食暂养2 d，试验用水为曝气的池塘用水，盐度为0.56 g/L，碱度为4.2 mmol/L，pH 为7.93，硬度为234 mg/L，氨氮0.69 mg/L 和总铁0.64 mg/L。试验容器是规格为64 cm×45 cm×28 cm白色硬质塑料箱，试验用NaHCO3及其它药品均为国产分析纯。

1.2 试验方法

试验前进行5 种幼鱼NaHCO3胁迫预实验，然后根据预实验结果分别设置5 个碱度梯度及1 个对照组，每个浓度梯度设置3 个平行，实验结果取其平均值。试验溶液按每组50 L 水称取相应质量的NaHCO3配制，配制好后稳定24 h，用滴定法测定每个试验组的碱度，对浓度偏差较大的组别进行调整并再次测定其浓度，5 种鱼类的NaHCO3预设浓度和实测浓度见表1。每个浓度组随机放入幼鱼10 尾，试验期间不换水，不通气，静止放置96 h。试验期间溶解氧含量为6.53～6.71 mg/L，氨氮含量为，0.69～0.77 mg/L，温度为21.5～23.5 ℃。对5 种幼鱼死亡的判别标准是:幼鱼失去游泳能力，轻触鱼体无反应即视为死亡。

表1 5 种幼鱼碱度试验浓度梯度Tab.1 Concentration gradient of alkalinity in juveniles of 5 species

1.3 数据统计、样本采集及检测

观察和统计12 h，24 h，48 h，72 h，96 h 各浓度组试验鱼的活动情况，记录死亡时间和尾数，并立即采集死亡个体的鳃、肾组织。每种鱼每种组织分别取3 个样，浸泡在Bouins 液中固定。固定24 h 后，用70%的乙醇洗涤2～3 次，再保存于70%的乙醇中。固定好的组织用石蜡包埋，切片，厚度为5 μm，HE 染色，中性树胶封片，用Motic 2.0 光学显微镜观察、拍照。

1.4 数据处理与分析

试验数据利用Excel 软件(07 版)整理，并采用数据处理软件SPSS17.0 进行方差分析和半数致死浓度的计算［8］，P＜0.05 视为有统计学意义。采用t-检验对5 种鱼类的24 h，48 h，72 h，96 h 的碱度半致死浓度(Half lethal concentration，LC50)进行差异分析，P＜0.05 为差异显著。采用安全浓度(Safe Concentration，SC)常用计算公式SC=96 h LC50×0.1［9］计算出碱度对5 种鱼类的安全浓度。

2 结果与分析

2.1 NaHCO3碱度胁迫下5 种幼鱼的行为反应

5 种幼鱼放入高浓度NaHCO3溶液后，初期表现为绕试验容器迅速的游动，大鳞鲃、镜鲤、鲢鱼甚至出现跳出容器;随着试验时间的延长，幼鱼出现狂游，且在游动时，身体出现侧翻现象，无法维持身体平衡;随后，幼鱼的游泳速度逐渐变得缓慢，活动减弱，对外界刺激反应减弱，最后死亡;在鱼体死亡前，鲫鱼虽无鳃动，但较长时间仍能对外界刺激有反应，而其它幼鱼无鳃动即刻死亡;5 种幼鱼出现异常反应的时间都会随着NaHCO3浓度的升高而缩短。在试验期间幼鱼体表粘液的分泌则减少，鱼体表层变黑，失去光泽，个别眼睛发白，鳃部出血。而对照组在整个试验期间，5 种幼鱼游泳行为正常，体表无异常变化，无死亡现象。

表2 5 种幼鱼在不同NaHCO3浓度下的死亡率Tab.2 Mortality in different concentrations of NaHCO3in juveniles of 5 species

2.2 不同NaHCO3浓度下的死亡率

5 种幼鱼在不同NaHCO3浓度下12 h，24 h，48 h，72 h 和96 h 时的死亡率见表2。结果显示，5 种幼鱼的死亡率随着时间的延长、NaHCO3浓度的增大而升高，毒性效应与曝露时间、NaHCO3浓度呈正相关。

2.3 不同NaHCO3浓度下的半致死浓度

通过5 种幼鱼的死亡率计算获得NaHCO3半致死浓度，以及死亡率与NaHCO3浓度的关系方程(表3)。5 种幼鱼的NaHCO3碱度96 h 半致死浓度(LC50)分别为:大鳞鲃123.097 mmol/L，草鱼92.936 mmol/L，镜鲤113.038 mmol/L，鲫鱼139.832 mmol/L，白鲢87.970 mmol/L，通过经验公式计算得出5 种幼鱼的NaHCO3安全浓度分别为12.310 mmol/L，9.294 mmol/L，11.304 mmol/L，13.983 mmol/L，8.797 mmol/L。由5 种幼鱼的NaHCO3半致死浓度和安全浓度可知，耐受能力大小顺序依次为:鲫鱼，大鳞鲃，镜鲤，草鱼，白鲢。

表3 5 种幼鱼的急性碱度半致死浓度Tab.3 Acute LC50of alkalinity in juveniles of 5 species

对5 种鱼类幼鱼的曝露时间和对应的NaHCO3半致死浓度作图，得到5 种幼鱼的NaHCO3浓度反应曲线(图1)。5 种鱼类的NaHCO3半致死浓度随着时间的延长而降低，大鳞鲃、镜鲤和白鲢的NaHCO3毒性反应曲线趋于平缓，这表明幼鱼的NaHCO3LC50不再继续降低，死亡率不再升高;草鱼和鲫鱼的NaHCO3毒性反应曲线仍呈下降的趋势，死亡率随时间延长仍有所降低。由图1 可知，镜鲤在曝露48 h 时反应曲线即趋于平稳，鲫鱼和白鲢在曝露72 h 趋于平稳，而大鳞鲃和草鱼在试验终止反应曲线也未完全与横轴平行，这说明在碱度胁迫下的适应时间镜鲤最短，其次为鲫鱼和白鲢，大鳞鲃和草鱼较长。

2.4 NaHCO3碱度胁迫下5 种幼鱼鳃、肾组织的结构变化

通过观察发现，对照组5 种幼鱼的鳃丝分布均匀，细胞饱满，排列紧密;鳃小片均匀的分布在鳃丝两侧，鳃小片上皮细胞饱满无损伤，大鳞鲃、鲫鱼和镜鲤的鳃丝较草鱼、白鲢密集，鳃小片结构也较草鱼和白鲢复杂(图2，1～5)。但在高浓度NaHCO3胁迫下，鳃结构变化基本相同，鳃小片缩短，细胞间隙增大，鳃小片上皮细胞出现不同程度的水肿，甚至脱落现象(图2，6～10)。

图1 5 种幼鱼的急性碱度反应Fig.1 Acute alkalinity response in juveniles of 5 species

通过观察发现，对照组的肾组织结构充实，肾小球发达，肾小管粗壮;结构完整，细胞无损伤，5 种幼鱼的肾组织结构无明显的差异(图3，11～15)。但在高NaHCO3浓度试验组中，肾小管上皮细胞会出现不同程度的萎缩，肾小管管腔变大(图3，11～15)。

图2 NaHCO3对5 种幼鱼鳃组织的影响Fig.2 Impact of NaHCO3on gill structure in juveniles of 5 species

图3 NaHCO3对5 种鱼类肾脏组织的影响Fig.3 Impact of NaHCO3on kidney structure in juveniles of 5 species

3 讨论

3.1 NaHCO3碱度对鱼类的急性毒性作用

我国低洼盐碱地区的水型较复杂，离子组成不尽相同，其中CO32-、HCO3-是影响水体中碱度的主要离子，直接或间接的影响了水生生物的生长和生存［10］。一般在实验室条件下，多数研究者都会使用NaHCO3浓度作为生物耐碱能力的指标［5，11-12］。鱼类在高碱度水体中，组织器官会产生相应的损伤和结构变化。史为良在对达里湖鱼类进行调查时发现雅罗鱼体表溃烂，烂鳍或瞎眼［13］，雷衍之等报道在高碱度水体中鲢鱼、鳙鱼(Aristichthys nobilis)和草鱼鳃部出血［14］。本研究选择NaHCO3进行了5 种鱼类的碱度毒性试验，并发现在高碱度溶液中鱼体表层变黑，失去光泽，个别个体出现眼睛发白、鳃部出血现象。

史为良在对达里湖鱼类进行调查时认为鱼类的死亡是由高pH 与高碱度的共同作用引起，并发现达里湖鱼类的死亡与CO32-、HCO3-的含量有关［13］;雷衍之等在研究碳酸盐对鱼类的毒性作用时着重分析了CO32-、HCO3-和OH-的相互作用关系，得出碱度相同时，pH 越高，致死作用越大;pH 相同时，碱度越大，致死作用也越大。在高碱度条件下，几种鱼类的耐受能力大小依次为青海湖裸鲤(Gymnocypris przewalskii)，瓦氏雅罗鱼(Leuciscus waleckii)，鲫鱼，鲤鱼(Cyprinus carpio)，尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)，草鱼，鳙鱼，鲢鱼［14］。本研究也发现在正常pH 范围内，5 种幼鱼死亡率随着NaHCO3浓度增大、曝露时间、延长而升高，且不同品种的幼鱼对碱度的耐受力存在显著差异，耐受力大小依次为鲫鱼，大鳞鲃，镜鲤，草鱼，鲢鱼，这些结果与史为良和雷衍之等研究结果相近。

研究表明，广盐性硬骨鱼类由淡水中转入高盐度水体中，鱼体组织结构和生理机能会产生适应性改变［15-16］，鱼类在碱性水体中也存在相似的适应性变化，但这种适应不能超过鱼体的耐受极限［17-19］。此外，鱼类对碱度的适应因种类的不同而呈现多样性，本研究发现5 种鱼类曝露在相同碱度下出现的生理反应和效应时间各有差异，如鲫鱼在死亡前，虽无鳃动，但较长时间仍能对外界刺激有反应，而其它幼鱼无鳃动即刻死亡。

3.2 NaHCO3碱度对鱼类鳃、肾组织结构的影响

鳃是鱼类与外界环境进行物质交换的主要器官，易于受到外界环境的干扰而影响其正常生理功能的进行。鱼类在对碱度胁迫的适应过程中，鳃的组织结构也发生不同程度的适应性改变。姜秋俚等发现高NaHCO3作用下咸海卡拉白鱼(Chalcalburnus chalcoides aralensis)的鳃小片缩短，鳃小片上皮细肥大，肿胀和脱落［20］。本研究也发现在高碱度试验组中，5 种试验幼鱼的鳃小片缩短，细胞间隙增大，导致鳃丝萎缩。这是由于水体中的碱度增大，部分离子进入血液中，血浆的渗透压会升高，鱼体为了满足渗透调节的能量需求，鳃组织结构随即发生适应性变化。笔者认为鳃丝萎缩使得鳃小片间隙增大，流经鳃丝的水量增大;鳃丝直径减小，使得比表面积*增大，这些都会有利于氧气的摄取及能量物质的分解，这一结论还需进一步的实验证明。

鱼类的肾脏是鱼体进行渗透调节的重要器官，外界环境的异常会导致肾组织结构相应的变化，因此，可作为鱼类盐碱度适应范围和最适盐碱度的指标［21］。研究发现，在低渗环境下肾组织结构充实，肾小球发达，肾小管粗壮;而在高渗条件下，肾脏会退化，肾小球缩小甚至消失，肾小管缩短［22］。D L Galat等对生活在不同盐碱湖泊的褐色鲑(Salmo clarki lewisi)等的肾脏进行观察时也得到了相同的结论［23］，姜秋俚等也发现在NaHCO3碱度胁迫下卡拉白鱼的肾脏也发生类似的变化［17］。本试验对照组幼鱼肾脏组织结构充实，肾小球发达，肾小管粗壮，但在高浓度NaHCO3试验组也观察到的肾组织肾小管出现不同程度的萎缩，肾小管管腔变大。这可能是由于在高碱度水体中，鱼体的渗透压会随之升高，为了维持体内的平衡，鱼体就会补充大量的水分，这时肾组织排出的水分相应减少，而肾小管就会出现不同程度的萎缩。

在高盐碱水体中，鱼类除了鳃和肾脏组织参与离子的调控和渗透压的调节，Nelsen 等在对褐色鲑的研究中发现，幽门盲囊也参与了渗透压的调节［24］。此外，童燕，Rotllant J 和徐力文等认为鱼体中肾上腺皮质激素［25］、消化酶、碱性磷酸酶和非特异性免疫酶类［26-27］等参与渗透压的调节。由此可知，鱼类在异常的盐碱环境中渗透压调节是由多个器官间协同作用来维持的，因而要想查清鱼类在盐碱条件下的渗透压调控机制仍需要进行进一步的探索。

* 注:比表面积(specific surface area)是指单位质量物料所具有的总面积，是表示固体吸附能力的重要参数。比表面和粒度有一定关系的，根据国家标准GB1774-88 比表面与粉末粒度关系的计算公式(假定为球形)为:d=6/ps，其中d—平均粒径(μm)，ρ—密度(g/cm3)，S—比表面(m2/g)。

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