阿维A对HaCaT细胞体外凋亡和胰岛素样生长因子结合蛋白7及血管内皮生长因子表达的影响

相风梅 魏志平 钟连生 杨青 刘彦群

·论著·

阿维A对HaCaT细胞体外凋亡和胰岛素样生长因子结合蛋白7及血管内皮生长因子表达的影响

相风梅 魏志平 钟连生 杨青 刘彦群

目的探讨阿维A对HaCaT细胞体外凋亡和胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)及血管内皮生长因子(VEGF) 表达的影响。方法将10-5、10-6、10-7、10-8mol/L的阿维A分别作用于HaCaT细胞24、48、72 h后,采用CCK8法检测细胞增殖情况;流式细胞仪检测阿维A对HaCaT细胞凋亡率的影响;Western印迹和RT-PCR法检测阿维A对HaCaT细胞IGFBP7、VEGF蛋白及其mRNA表达的影响。结果10-8mol/L阿维A处理HaCaT细胞48 h时表现出对细胞增殖的抑制作用,随着时间延长和药物浓度升高,抗增殖作用亦增强,当药物浓度增加到10-5mol/L时,48 h和72 h的抑制率分别为39.94%±2.27%和49.77%±1.87%。与对照组相比,10-5mol/L阿维A作用48 h后,凋亡率由1.803%±0.313%(对照组)上升至7.617%±0.767%(阿维A组)(P＜0.05),IGFBP7的表达由0.436±0.013上升至0.939±0.040(P＜0.05),IGFBP7 mRNA的表达由0.190±0.056上升至0.872±0.079(P＜0.05),VEGF的表达由0.798±0.036下降至0.213±0.032(P＜0.05),VEGF mRNA的表达由0.933±0.054下降至0.274±0.041(P＜0.05)。结论阿维A可促进HaCaT细胞的体外凋亡,并可在蛋白及mRNA水平上调IGFBP7及下调VEGF的表达。

阿维A;细胞凋亡;胰岛素样生长因子结合蛋白质类;血管内皮生长因子;HaCaT细胞

胰岛素样生长因子结合蛋白7(insulin-like growth factor binding protein 7,IGFBP7)是一种广泛分布于正常人体组织器官的分泌性糖蛋白,在多种组织细胞的增殖、分化、衰老、凋亡、癌变等病理生理过程中起重要作用,可抑制多种肿瘤细胞的生长[1]。阿维A是治疗银屑病疗效较好的第2代维A酸类药物,其药理作用主要为抑制角质形成细胞的增殖,诱导其分化及凋亡,并具有免疫调节作用。本实验研究了阿维A对HaCaT细胞体外凋亡及IGFBP7和血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响,初步探讨阿维A治疗银屑病可能的新的作用机制。

材料与方法

一、试剂和仪器

阿维A(acitretin)由重庆华邦制药股份有限公司提供,RPMI 1640培养基为美国Gibco公司产品,胎牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司产品,兔抗人IGFBP7多克隆抗体为美国Abcam公司产品,鼠抗人VEGF单克隆抗体、鼠抗人β肌动蛋白单克隆抗体、碱性磷酸酶标记山羊抗兔IgG、马抗小鼠IgG抗体均为北京中杉金桥生物技术有限公司产品,BCA试剂盒为碧云天生物技术研究所产品,RT-PCR引物设计合成于上海生工生物工程技术服务有限公司,逆转录及PCR试剂盒为北京天根生化科技有限公司产品,Annexin-V-FITC凋亡检测试剂盒为北京宝赛生物公司产品,流式细胞仪为美国Becton Dickinson公司产品。人永生化角质形成细胞株HaCaT细胞购自上海复祥生物科技有限公司。阿维A以二甲基亚砜(DMSO)配制成浓度为10-1mol/L储存液(DMSO浓度≤1‰),-20℃避光保存,用时用培养液稀释。

二、方法

1.细胞培养及实验分组:HaCaT细胞培养于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/L链霉素的RPMI 1640培养液中,置于37℃ 5%CO2饱和湿度培养箱中培养,待细胞长成致密单层后,以含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶溶液消化细胞,接种于培养瓶内,置培养箱中培养24 h贴壁后,更换无血清、无双抗RPMI 1640培养液,加入不同浓度阿维A,48 h后进行各种指标检测。试验分为:10-5mol/L、10-6mol/L、10-7mol/L、10-8mol/L 阿维 A 组及只加RPMI 1640培养液的对照组。

2.CCK8法检测HaCaT细胞增殖抑制率:取HaCaT细胞3×103/ml接种于96孔培养板,每孔100 μl,培养24 h,细胞贴壁后,各实验组按上述设计分别加入不同浓度的阿维A,并增设与10-5mol/L阿维A组所含等体积DMSO为溶媒组。每组设6个复孔,分别培养24、48、72 h后终止培养,弃去原培养基,按新鲜无抗、无血清RPMI 1640培养液与CCK8比例为10∶1混匀,每孔加入100 μl混匀液,于培养箱中孵育2 h,酶标仪测定450 nm波长处每孔的吸光度(A值),实验重复3次,计算细胞增殖抑制率,抑制率=(1-给药组A值/对照组A值)×100%。

3.流式细胞仪Annexin V/PI检测HaCaT细胞早期及中晚期总凋亡率:以每孔1×105细胞接种于6孔板内,24 h后按上述分组用不同浓度阿维A处理细胞,每个浓度设3个复孔,48 h后以胰酶处理细胞,约3～5 min后用含血清的培养基终止消化,用4℃预冷磷酸盐缓冲液轻轻吹打成单细胞悬液,4℃ 179×g离心5 min后弃上清,重复3次,将各组细胞沉淀分别重悬于200 μl结合缓冲液,并分别加入10 μl Annexin V-FITC混匀,室温避光反应15 min后,分别加入300 μl结合缓冲液以及5 μl碘化丙锭(PI)染液,在1 h内上机检测。

4.Western印迹法检测HaCaT细胞IGFBP7及VEGF的表达:分组同上,48 h后收集各组细胞,提取总蛋白,用BCA法检测蛋白浓度,上样80 μg进行电泳、转膜及封闭,一抗孵育(兔抗人IGFBP7多克隆抗体的工作浓度为1∶1 000,兔抗人VEGF单克隆抗体为1∶200,鼠抗人β肌动蛋白单克隆抗体为1∶500),4℃过夜,二抗孵育(山羊抗兔IgG抗体的工作浓度为1∶500,马抗小鼠IgG抗体为1∶500)2 h,BCIP/NBT显色液显色,凝胶成像系统观察结果,目的蛋白条带IGFBP7、VEGF与相应的内参β肌动蛋白条带的灰度值比值(IGFBP7/β肌动蛋白、VEGF/β肌动蛋白)作为其蛋白水平的半定量指标。

5.RT-PCR法检测HaCaT细胞IGFBP7、VEGF mRNA的表达:各组细胞培养48 h后提取细胞总RNA,逆转录合成cDNA,目的基因IGFBP7上游引物:5'-CAGGTGTACTTGAGCTGTGA-3',下游引物:5'-CATGTAAGGCATCAACCACTGT-3',扩增片段为286 bp。VEGF上游引物:5'-CATGAACTTTCTGCTG TCTTGG-3',下游引物:5'-GGTCTGCATTCACATTT GTTGT-3',扩增片段为396 bp。内参β肌动蛋白上游引物:5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3',下游引物:5'-CTGGAAGGT GGACAGCGAGG-3',扩增片段为205 bp。采用逆转录试剂盒将其逆转录得到cDNA。PCR反应体系为25 μl,扩增条件为:94℃预变性3 min,94℃变性30 s,57℃退火30 s,72℃延伸45 s,共35个循环,最后72℃延伸5 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后,用凝胶成像系统扫描拍照,检测各电泳条带的灰度值,计算与β肌动蛋白比值,得到目的产物的相对含量。

6.统计学分析:采用SPSS13.0统计软件进行分析,计量资料用±s表示。多个均数比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)。相关分析用Pearson相关分析。检验水准α=0.05,P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、阿维A对HaCaT细胞体外增殖的影响

结果见图1。10-8mol/L阿维A处理的HaCaT细胞,48 h时对细胞增殖的抑制作用与对照组相比差异开始有统计学意义(P＜0.05),故选择培养48 h为以下实验的时间段,且随着时间延长和药物剂量的加大,抗增殖作用愈明显,当药物浓度增加到10-5mol/L时,48 h和72 h的抑制率分别为39.94%±2.27%和49.77%±1.87%。与对照组相比,各浓度不同时间段溶媒组对HaCaT细胞体外增殖的抑制率(24、48、72 h 时分别为 1.53%±0.91%、1.93%±0.82%、2.35%±0.73%)差异无统计学意义(均P＞0.05),故忽略此DMSO实验剂量对HaCaT细胞的影响,以下实验舍弃溶媒组。

二、阿维A对HaCaT细胞体外凋亡率的影响

流式细胞仪检测结果显示,10-5、10-6、10-7、10-8mol/L阿维A作用HaCaT细胞48 h后,各实验组早期及中晚期细胞总凋亡率分别为7.62%±0.77%、5.39%±0.83%、3.84%±0.62%、3.00%±0.31%,与对照组总凋亡率(1.80%±0.31%)相比,差异有统计学意义(P＜0.05),其中以10-5mol/L阿维A组作用最强。

三、阿维A对HaCaT细胞IGFBP7及其mRNA表达的影响

结果见图2、3及表1。结果表明,不同浓度阿维A作用于HaCaT细胞48 h后,与对照组相比,IGFBP7及其mRNA的表达均升高,差异有统计学意义(P＜0.05)。当阿维A浓度增加到10-5mol/L时,IGFBP7/β肌动蛋白灰度比由对照组0.436±0.013上升至0.939±0.040,IGFBP7 mRNA/β肌动蛋白mRNA灰度比由对照组0.190±0.056上升至0.872±0.079,差异有统计学意义(均P＜ 0.05)。

图1 阿维A对HaCaT细胞体外增殖的抑制率

图2 阿维A对HaCaT细胞胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)表达的影响 1 ～ 4:分别为 10-5、10-6、10-7、10-8mol/L 阿维A;5:对照组

图3 阿维A对HaCaT细胞胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)mRNA表达的影响 1:标准参照物;2～5:分别为10-5、10-6、10-7、10-8mol/L 阿维 A;6:对照组

表1 阿维A对HaCaT细胞胰岛素样生长因子结合蛋白7及血管内皮生长因子及其mRNA表达的影响(±s)

表1 阿维A对HaCaT细胞胰岛素样生长因子结合蛋白7及血管内皮生长因子及其mRNA表达的影响(±s)

注:n=3。 a:与对照组相比,P＜0.05

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四、阿维A对HaCaT细胞VEGF及其mRNA表达的影响

结果见图4、5及表1。结果表明,不同浓度阿维A作用于HaCaT细胞48 h后,与对照组相比,VEGF及其mRNA的表达降低,差异有统计学意义(均P＜0.05)。当阿维A浓度增加到10-5mol/L时,VEGF/β肌动蛋白灰度比由对照组0.798±0.036下降至0.213±0.032,VEGF mRNA/β肌动蛋白 mRNA灰度比由对照组0.933±0.054下降至0.274±0.041,差异有统计学意义(均P＜0.05)。

图4 阿维A对HaCaT细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响 1 ～ 4:分别为 10-5、10-6、10-7、10-8mol/L 阿维 A;5:对照组

图5 阿维A对HaCaT细胞血管内皮生长因子(VEGF)mRNA表达的影响 1～4: 分别为10-5、10-6、10-7、10-8mol/L阿维A;5:对照组;6:标准参照物

五、HaCaT细胞IGFBP7 mRNA表达与细胞凋亡率及VEGF mRNA表达量相关性分析

利用SPSS13.0统计软件进行双变量相关分析,结果显示,不同浓度阿维A处理后,IGFBP7 mRNA表达量与HaCaT细胞凋亡率呈显著正相关,r=0.96,P＜0.05;与VEGF mRNA表达量呈显著负相关,r=-0.94,P＜0.05。

讨 论

研究表明,IGFBP7可调节多种肿瘤细胞的增殖、黏附、衰老和血管生成,在多种类型肿瘤中具有抑癌基因的功能[2]。IGFBP7在正常表皮组织中广泛表达,而在银屑病患者表皮中表达下调,经UVB治疗后其表达可恢复正常[3]。Nousbeck等[4]发现,下调IGFBP7的表达可显著促进角质形成细胞增殖,抑制其凋亡,而重组IGFBP7(recombinant IGFBP7,rIGFBP7)则可抑制角质形成细胞增殖,促进其凋亡。维A酸类药物治疗银屑病与其对角质形成细胞增殖、分化及凋亡等过程的调控有关。Torma等[5]认为,银屑病皮损部位的维A酸受体信号转导途径存在异常,但其与银屑病发病机制的具体关系尚不清楚。本实验流式细胞仪检测结果表明,不同浓度阿维A均能诱导HaCaT细胞的凋亡。Western印迹检测到随着阿维A浓度的增加,IGFBP7的表达逐渐升高,且统计学分析显示,HaCaT细胞凋亡率与IGFBP7 mRNA的表达量呈显著正相关,即随着IGFBP7表达量的升高,对凋亡的诱导作用逐渐增强,推测此作用机制可能为阿维A通过结合维A酸受体上调IGFBP7的表达从而诱导凋亡的发生。

银屑病血管生成与促血管生成因子VEGF等表达上调密切相关[6]。血管内皮细胞包含特异的存储细胞器,称为Weibel-Palade小体(WPB),可运输炎性及凝血性介质至血管腔以对血管加压素等产生应答,蛋白质组学筛查表明,IGFBP7为WPB的一种新的组成部分,这一发现提示IGFBP7在调节血管生成方面有重要作用[7]。研究表明,IGFBP7高表达可抑制肿瘤组织中新生血管生成,并降低裸鼠皮下移植瘤模型的微血管密度,重组IGFBP7可抑制小鼠肝细胞癌模型中VEGF诱导的血管形成及其下游效应信号分子的表达[2]。Chen等[2]利用pcDNA3.1-IGFBP7转染小鼠恶性黑素瘤细胞,证实IGFBP7通过诱导黑素瘤细胞凋亡及下调VEGF的表达抑制肿瘤的生长,认为IGFBP7抑制血管生成可能是其抑制肿瘤发生发展的机制之一。研究表明,胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor,IGF)-Ⅰ与其受体结合时,可通过上调VEGF的表达来增加新生血管生成以促进肿瘤生长[8],IGFBP7可参与IGF和胰岛素等信号转导的调节,IGFBP7通过与IGF-Ⅰ竞争性结合其受体以调节体液及肿瘤组织中IGF-Ⅰ的浓度,从而减少VEGF的合成来实现其调控肿瘤组织中血管生成的作用[9]。

有研究表明,维A酸对VEGF有一定的调节作用[9],但其具体的调控途径尚不清楚。本实验发现,阿维A能够上调HaCaT细胞IGFBP7及mRNA的表达,并下调VEGF及mRNA的表达。统计学分析显示,随着阿维A浓度的增加,IGFBP7及其mRNA表达量逐渐升高,VEGF及其mRNA表达量逐渐下调,表明阿维A对IGFBP7及VEGF有调控作用。本实验只是初步探讨阿维A治疗银屑病可能的作用机制,存在一定的局限性,有待于进一步研究。

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2013-11-04)

(本文编辑:颜艳)

In vitroeffects of acitretin on the apoptosis and expressions of insulin-like growth factor binding protein 7 and vascular endothelial growth factor in HaCaT cells

Xiang Fengmei*,Wei Zhiping,Zhong Liansheng,Yang Qing,Liu Yanqun.*Department of Dermatology,Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College,Xuzhou 221002,Jiangsu,China

Wei Zhiping,Email:xzwzp1961@aliyun.com

ObjectiveTo investigate thein vitroeffects of acitretin on the apoptosis and expressions of insulin-like growth factor binding protein 7(IGFBP7)and vascular endothelial growth factor(VEGF)in HaCaT cells.MethodsCultured HaCaT cells were treated with various concentrations(10-5,10-6,10-7,10-8mol/L)of acitretin for various durations,with those cultured in acitretin-free medium serving as the control group.Then,CCK-8 assay was performed to evaluate the proliferation of cells after 24-,48-and 72-hour treatment,flow cytometry to detect the apoptosis of HaCaT cells,and Western blot and reverse transcription-PCR to quantify the protein and mRNA expressions of IGFBP7 and VEGF in HaCaT cells,respectively,after 48-hour treatment.Statistical analysis was carried out by one-way analysis of variance and Pearson correlation analysis.ResultsThe proliferation of HaCaT cells was inhibited by the treatment with acitretin,and the inhibitory effect increased with the elevation of concentration and prolongation of treatment duration of acitretin.A significant decrease was observed in the proliferative activity of HaCaT cells treated with acitretin of 10-8mol/L for 48 hours,and when the concentration of acitretin was 10-5mol/L,the proliferation of HaCaT cells was inhibited by 39.94%±2.27%and 49.77%±1.87%at 48 and 72 hours respectively,compared with the control cells.The HaCaT cells treated with acitretin of 10-5mol/L for 48 hours showed a significant elevation in apoptosis rate(7.617%±0.767%vs.1.803%±0.313%,P＜0.05),IGFBP7 protein and mRNA expressions(0.939±0.040 vs.0.436±0.013,0.872±0.079 vs.0.190±0.056,bothP＜0.05),but a significant reduction in VEGF protein and mRNA expressions(0.213±0.032 vs.0.798±0.036,0.274±0.041 vs.0.933±0.054,bothP＜0.05)in comparison to the control cells.ConclusionsAcitretin can induce the apoptosis of HaCaT cells,and up-regulate IGFBP7 but down-regulate VEGF expressions in HaCaT cells at protein and mRNA levels.

Acitretin;Apoptosis;Insulin-like growth factor binding proteins;Vascular endothelial growth factors;HaCaT cells

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.07.012

221002江苏,徐州医学院附属医院皮肤科(相风梅、魏志平、钟连生、杨青);江苏省医学会(刘彦群)

魏志平,Email:xzwzp1961@aliyun.com