双水相法提取澳洲茶树黄酮研究

毕荣璐+王加兴+凌清华+熊智+刘祥义

摘 要：为优化双水相法提取澳洲茶树中黄酮类化合物的条件，以澳洲茶树叶的总黄酮提取率为评价指标，分别对双水相的溶剂饱和程度、乙醇浓度、料液比、提取时间、提取温度对黄酮提取率影响进行了探究。结果表明，双水相提取优化条件为溶剂饱和度磷酸二氢钾∶乙醇1∶2（w/v），70%（v/v）乙醇，料液比1∶20（w/v），提取时间为90min，提取温度90℃。提取率最高6.74%。双水相提取澳洲茶树黄酮提取率较高，且分相时间短，不存在有机溶剂残留，易于工艺放大和连续操作，是一种理想的提取方法。

关键词：澳洲茶树；黄酮；提取；双水相法

中图分类号 S79 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2014）22-39-04

Study on Aqueous Two-phase Extraction of Flavonoids from Melaleuca ahemifolia

Bi Ronglu1 et al.

（1Southwest Forestry University，Kunming 650224，China）

Abstract：The study was based on the evaluation index of flavonoids from melaleuca ahemifolia Extraction efficiency，to optimizate method of Aqueous two-phase extraction of flavonoid compounds in Australia tea tree. The main research content including solvent saturated degree，ethanol concentration，solid-liquid ratio，extraction time，extraction temperature effect on flavonoids extraction yield of aqueous two-phase. The result showed that the conditions were ethanol 1∶2（w/v），70%（v/v）ethanol，material liquid than 1∶20（w/v），the extraction time was 90 min，extraction temperature 90℃，extraction efficiency rached to 6.74%. The rate of flavonoids is high by the method of aqueous two-phase，and the phase separation time is short，there is no organic solvent residue，easy to process scale and continuous operation，is an ideal extraction method.

Keywords：Melaleuca ahemifolia；Flavonoids；Extraction；Aqueous two-phase

澳洲茶树又名互叶白千层（Melaleuca ahemifolia），是桃金娘科（Myrtaceae）、白千层属（Melaleuca L.）植物，原产于澳洲，现我国广东、广西、云南等地均已广泛种植。澳洲茶树适应性强，生长迅速，具有一定的抗寒性，故可用于园林绿化，但该植物最主要的用途是提取澳洲茶树油，俗称“茶树精油”。茶树精油具有强力的消炎杀菌功效，并在心理疗效、生理疗效、皮肤疗效等方面有一定的作用，现已广泛用于日常生活的各个领域[1-3]。此外，澳洲茶树叶中含有黄酮类化合物[4-5]，而黄酮类化合物具有多种多样的生物活性和药理作用，其对于心脑血管疾病及降低胆固醇、高血压等都有很好的作用[6]。为避免澳洲茶树枝叶提取精油后剩余部分被作为废弃料处理，提高澳洲茶树资源的利用率，本试验以澳洲茶树叶中总黄酮提取率为指标，分别对双水相的溶剂饱和程度、乙醇浓度、料液比、提取时间、提取温度对黄酮提取率的影响进行了研究，以期为澳洲茶树叶资源的综合利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料（1）澳洲茶树树叶，由云南森源化工有限公司提供。（2）主要仪器：DZF-6030B型真空干燥箱，购自上海恒科公司；JJ-2植物组织粉碎机，购自北京中兴伟业仪器公司；HH-S型恒温水浴箱，购自郑州长城科工贸有限公司；722型可见光分光光度计，购自上海精密科学仪器公司；电子天平，购自梅特勒-托利多仪器上海有限公司。（3）主要试剂：芦丁标准品98%，购自南京泽朗植提技术有限公司；磷酸二氢钾、硝酸铝、亚硝酸钠、无水乙醇、石油醚、氢氧化钠及盐酸均为分析纯，市售。

1.2 试验方法

1.2.1 线性关系的考察[7-11] 准确称取已于105℃干燥恒重的芦丁标样31.50mg，用70%乙醇溶解定容于100mL容量瓶，摇匀（0.315mg/mL）备用；分别取上述芦丁溶液0、2.0mL、4.0mL、6.0mL、8.0mL于5只10mL容量瓶中，加入2mL亚硝酸钠（5%），摇匀。放置6min后加入6mL硝酸铝（10%），摇匀。6min后再加入20mL浓度为4%的氢氧化钠，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，10min后于波长510nm处测定吸光度值A，试剂为空白参比。记录数据，绘制标准曲线，得到芦丁溶液质量浓度C与吸光度值A的回归方程式。

1.2.2 黄酮含量的测定 准确移取澳洲茶树样品待测液于容量瓶中进行显色和吸光度A的测定，用回归方程式计算得到待测液中黄酮的浓度C，然后按下式计算得到总黄酮含量：endprint

样品的总黄酮含量（%）=（C×4）/M×100

式中：M为样品质量（g）；C为样品液的总黄酮浓度（mg/mL）。

1.2.3 仪器精密度试验 准确移取标准品液（0.315mg/mL）2mL于50mL比色管中，加入2mL亚硝酸钠（5%），摇匀。6min后加入6mL硝酸铝（10%），摇匀。6min后再加入20mL浓度为（4%）的氢氧化钠，用蒸馏水定容至刻度，摇匀。15min后于波长510nm处测定吸光度值A。连续测定6次，计算黄酮含量和相对标准偏差（RSD），考察仪器精密度。

1.2.4 显色稳定性试验 准确移取待测液2mL于50mL比色管中，加入2mL亚硝酸钠（5%），摇匀。放置6min后加入6mL硝酸铝（10%），摇匀。6min后再加入20mL浓度为4%的氢氧化钠，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，15min后于波长510nm处测定吸光度值A。每隔1h测量1次，测量8次，计算黄酮含量和相对标准偏差（RSD），考察样品液的显色稳定性。

1.2.5 单因素试验

1.2.5.1 乙醇浓度对澳洲茶树黄酮提取率的影响 准确称取已预处理的澳洲茶树样品于圆底烧瓶中，料液比1∶20（w/v），磷酸二氢钾饱和度为1∶2（w/v），改变乙醇浓度，于80℃水浴中回流提取2h，将提取液连同样品一起转移至100mL容量瓶中，定容。然后取上清液部分作为待测液，测定吸光度。

1.2.5.2 料液比对澳洲茶树黄酮提取率的影响 准确称取已预处理的澳洲茶树样品于圆底烧瓶中，在70%乙醇，磷酸二氢钾饱和度为1∶2（w/v），改变料液比，于80℃水浴中回流提取2h，然后进行测定。

1.2.5.3 回流时间对澳洲茶树黄酮提取率的影响 准确称取已预处理的澳洲茶树样品于圆底烧瓶中，在70%乙醇，磷酸二氢钾饱和度为1∶2（w/v），料液比1∶20（w/v），于80℃水浴中回流提取不同时间，然后进行测定。

1.2.5.4 双水相饱和程度对澳洲茶树黄酮提取率的影响 准确称取已预处理的澳洲茶树样品于圆底烧瓶中，在70%乙醇，料液比1∶20（w/v），改变磷酸二氢钾饱和度，于80℃水浴中回流提取2h，然后进行测定。

1.2.5.5 提取温度对澳洲茶树黄酮提取率的影响 准确称取已预处理的澳洲茶树样品于圆底烧瓶中，在70%乙醇，料液比1∶20（w/v），磷酸二氢钾饱和度为1∶2（w/v），于不同温度水浴中回流提取2h，然后进行测定。

1.2.6 正交试验 根据单因素试验结果，在磷酸二氢钾饱和度为1∶2（w/v）时，以乙醇浓度、料液比、回流时间、提取温度为考察因素，澳洲茶树总黄酮提取率为考察指标，设计L9（34）正交试验表，各因素水平如表l所示。

1.2.7 最佳工艺条件验证试验 在最佳条件组合下进行5次平行验证性试验，以考察最佳条件的合理性和可靠性。

2 结果与分析

2.1 线性关系考察 以芦丁对照品溶液浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标作图，得到标准曲线。计算得线性回归方程为：A=9.5278C+0.0041，R2=0.9994。试验结果表明，当芦丁质量浓度在0～50.4mg/L范围内时，服从朗伯-比尔定理，因此试验所得数据可靠。

2.2 仪器精密度试验 仪器精密度试验结果见表2。由表2可知，RSD为0.74%，表明仪器精密度良好。

2.3 显色稳定性试验 显色稳定性试验结果见表3。由表3可知，RSD为0.90%，表明样品溶液在8h内显色稳定。

2.4 单因素试验

2.4.1 不同乙醇浓度对澳洲茶树黄酮提取率的影响 由图1可知，当乙醇浓度在40%～60%时，黄酮类化合物得率和乙醇浓度成正比；当乙醇浓度大于60%（v/v）时，得率基本趋于稳定。说明乙醇浓度增大有利黄酮化合物溶解，但过大不易达到浓度平衡，还浪费乙醇。因此，乙醇浓度控制在60%～80%（v/v）较好。

图1 回流提取乙醇浓度对提取率的影响

2.4.2 不同料液比对澳洲茶树黄酮提取率的影响 由图2可知，当料液比在1∶10～l∶20时，得率和料液比成正比；当料液比大于1∶20时，得率基本保持不变。1∶10～l∶20前，提取剂量少，对化合物浸泡不充分，提取剂量在继续增大只会造成浪费，所以料液比选择范围为1∶20～1∶35较好。

图2 料液比对澳洲茶树黄酮提取率的影响

2.4.3 不同回流时间对澳洲茶树黄酮提取率的影响 由图3可知，提取时间在30～50min速度较快，60min后变化不大。溶剂进入细胞内，黄酮类化合物再从细胞内溶解到细胞外，达到浓度平衡需要一定的时间，一般在达到平衡之前，浸提时间溶出成正比，但到溶解平衡以后，延长浸提时间对黄酮类化合物的溶出量影响不大，可能还会增加其它杂质的溶出量并且还浪费时间。综合考虑，提取时间以60～90min为合适。

图3 回流提取时间对提取率的影响

2.4.4 不同双水相饱和度对澳洲茶树黄酮提取率的影响 由图4可知，饱和程度在1∶2.5～1∶5时得率变化较快，1∶2前变化不大。澳洲茶树黄酮类化合物在提取液刚饱和时得率较高，但过饱和后溶剂量会减少，所能溶解的样品就会减少，不利于提取并且还浪费资源。综合考虑，饱和程度在1∶1.5～1∶2.5为宜。

图4 双水相提起饱和程度对得率的影响

2.4.5 不同提取温度对澳洲茶树黄酮提取率的影响 由图5可知，提取温度在30～70℃时得率提高速度较快，70℃后变化不大。澳洲茶树黄酮类化合物从细胞内溶解到细胞外需要一定浓度的提取液，浓度低时化合物溶解不出来，但太高又不利于节约资源。综合考虑，提取温度以70～93℃为合适。

3 结论与讨论

本次试验采用双水相法探索了乙醇浓度、料液比、回流时间、双水相饱和度、回流提取温度5个单因素对澳洲茶树总黄酮提取率的影响，并进行了L9（34）正交试验。通过极差分析得出，最佳提取工艺条件组合为双水相饱和度磷酸二氢钾∶乙醇1∶2（w/v），70%（v/v）乙醇，料液比1∶20（w/v），提取时间90min，浸提温度90℃。最高得率6.74%。验证试验得率6.713%，证明该较优条件可靠。双水相提取不存在有机溶剂残留，不会引起（下转64页）（上接41页）生物活性取值失活或变性，易于工艺放大和连续操作，后续提纯工序可直接进行，无需进行特殊处理[12]。但双水相提取提取成本偏高，仍需要后续再进行进一步的研究完善。

参考文献

[1]陈碧华，吴丽君，李乾振，等.互叶白千层研究进展[J].福建林业科技，2010，3（4）：177-182

[2]张燕君，陈利芳.蒸馏时间与互叶白千层精油主要化学[J].林产化学与工业，2002，22（3）：33-35.

[3]钟振声，袁裕泉，樊丽妃.引种互叶白千层茶树油有效抑菌成分辨析[J].中山大学学报（自然科学版），2012，51（5）：7-13.

[4]田玉红，陈志燕，陶明有.互叶白千层挥发性成分的提取和分析[J].广西工学院学报，2008，22（3）：45-48.

[5]刘布鸣，董晓敏，黄艳，等.互叶白千层的化学成分研究[J].中草药，2011，42（7）：1282-1284.

[6]陆柏益，张英，吴晓琴，等.竹叶黄酮的抗氧化性及其心脑血管药理活性研究进展[J].林产化学与工业，2005，25（3）：120-124.

[7]魏永生，王永宁，石玉平，等.分光光度法测定总黄酮含量的实验条件研究[J].青海大学学报（自然科学版），2003，21（3）：61-63.

[8]郭丽冰，王蕾.降香总黄酮含量测定方法的研究[J].中药材，2008，31（5）：694-696.

[9]郑媛媛，李辰，封士兰，等.油橄榄叶中总黄酮含量测定方法探讨[J].光谱学与光谱分析，2011，31（1）：547-550.

[10]Liu J，Luo J G，Sun Y，et al.A simple method for the simultaneous decoloration and deproteinization of crude levan extract fromPaenibacillus polymyxa EJS-3 by macroporous resin[J].Bioresource technology，2010，19（3）：1-7.

[11]Kazuyoshi Yanagihara，Akihiro Ito，Tetsuya Toge，et al.Antiproliferative effects of isoflavones on human cancer celllines established from the gastrointestinal tract[J].Cancer Research，1993，（53）：5815-5821.

[12]李伟，朱自强，梅乐和，等.双水相萃取技术在药物分离和提取中的应用[J].化工进展，1998（1）. （责编：张宏民）endprint

图4 双水相提起饱和程度对得率的影响

2.4.5 不同提取温度对澳洲茶树黄酮提取率的影响 由图5可知，提取温度在30～70℃时得率提高速度较快，70℃后变化不大。澳洲茶树黄酮类化合物从细胞内溶解到细胞外需要一定浓度的提取液，浓度低时化合物溶解不出来，但太高又不利于节约资源。综合考虑，提取温度以70～93℃为合适。

3 结论与讨论

本次试验采用双水相法探索了乙醇浓度、料液比、回流时间、双水相饱和度、回流提取温度5个单因素对澳洲茶树总黄酮提取率的影响，并进行了L9（34）正交试验。通过极差分析得出，最佳提取工艺条件组合为双水相饱和度磷酸二氢钾∶乙醇1∶2（w/v），70%（v/v）乙醇，料液比1∶20（w/v），提取时间90min，浸提温度90℃。最高得率6.74%。验证试验得率6.713%，证明该较优条件可靠。双水相提取不存在有机溶剂残留，不会引起（下转64页）（上接41页）生物活性取值失活或变性，易于工艺放大和连续操作，后续提纯工序可直接进行，无需进行特殊处理[12]。但双水相提取提取成本偏高，仍需要后续再进行进一步的研究完善。

参考文献

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[10]Liu J，Luo J G，Sun Y，et al.A simple method for the simultaneous decoloration and deproteinization of crude levan extract fromPaenibacillus polymyxa EJS-3 by macroporous resin[J].Bioresource technology，2010，19（3）：1-7.

[11]Kazuyoshi Yanagihara，Akihiro Ito，Tetsuya Toge，et al.Antiproliferative effects of isoflavones on human cancer celllines established from the gastrointestinal tract[J].Cancer Research，1993，（53）：5815-5821.

[12]李伟，朱自强，梅乐和，等.双水相萃取技术在药物分离和提取中的应用[J].化工进展，1998（1）. （责编：张宏民）endprint

图4 双水相提起饱和程度对得率的影响

2.4.5 不同提取温度对澳洲茶树黄酮提取率的影响 由图5可知，提取温度在30～70℃时得率提高速度较快，70℃后变化不大。澳洲茶树黄酮类化合物从细胞内溶解到细胞外需要一定浓度的提取液，浓度低时化合物溶解不出来，但太高又不利于节约资源。综合考虑，提取温度以70～93℃为合适。

3 结论与讨论

本次试验采用双水相法探索了乙醇浓度、料液比、回流时间、双水相饱和度、回流提取温度5个单因素对澳洲茶树总黄酮提取率的影响，并进行了L9（34）正交试验。通过极差分析得出，最佳提取工艺条件组合为双水相饱和度磷酸二氢钾∶乙醇1∶2（w/v），70%（v/v）乙醇，料液比1∶20（w/v），提取时间90min，浸提温度90℃。最高得率6.74%。验证试验得率6.713%，证明该较优条件可靠。双水相提取不存在有机溶剂残留，不会引起（下转64页）（上接41页）生物活性取值失活或变性，易于工艺放大和连续操作，后续提纯工序可直接进行，无需进行特殊处理[12]。但双水相提取提取成本偏高，仍需要后续再进行进一步的研究完善。

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[9]郑媛媛，李辰，封士兰，等.油橄榄叶中总黄酮含量测定方法探讨[J].光谱学与光谱分析，2011，31（1）：547-550.

[10]Liu J，Luo J G，Sun Y，et al.A simple method for the simultaneous decoloration and deproteinization of crude levan extract fromPaenibacillus polymyxa EJS-3 by macroporous resin[J].Bioresource technology，2010，19（3）：1-7.

[11]Kazuyoshi Yanagihara，Akihiro Ito，Tetsuya Toge，et al.Antiproliferative effects of isoflavones on human cancer celllines established from the gastrointestinal tract[J].Cancer Research，1993，（53）：5815-5821.

[12]李伟，朱自强，梅乐和，等.双水相萃取技术在药物分离和提取中的应用[J].化工进展，1998（1）. （责编：张宏民）endprint