库尔勒香梨叶片中铁的含量表征及铁空间分布

刘泽军等

摘 要：为了解决库尔勒香梨叶片营养诊断中“铁素黄化悖论”问题，测定了库尔勒香梨正常绿叶和失绿黄化叶片的全铁、有效铁和质外体铁的含量，并在此基础上对全铁和有效铁的表征方法进行了研究。结果表明：香梨叶片产生缺铁黄化的直接原因是缺乏有效铁；缺铁黄化的叶片有时全铁含量相比于正常绿叶并不低；以叶面积为底数来表征香梨叶片铁含量，可以消除“黄化悖论”迷局；香梨叶片中铁的空间分布特征是质外体中占58%～64%。

关键词：库尔勒香梨；叶片；全铁；有效铁；质外体铁

中图分类号：S661.2 文献标识码： A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.08.003

Abstract：In order to solve the problem of "iron chlororsis paradox" in leaf nutrition diagnosis of Kuerle fragrant pear， the content of total iron，active iron and apoplastic iron in healthy leaf and chlorotic leaf of fragrant pear were measured. On this basis， the research method of characteristic of total iron and active iron was studied. The results showed that active iron deficiency was precipitating cause of iron chlorosis； the content of total iron in chlorotic leaf was no less than the healthy leaf； iron content indicated by specific leaf weight per area could eliminate the puzzle of "chlorosis paradox"； apoplastic iron accounted for more than 58%～64% of the total iron content in fragrant pear leaf.

Key words： Kuerle fragrant pear； leaf； total iron； active iron； apoplastic iron

在石灰质土壤中，缺铁失绿症是一种常见的植物缺素病。库尔勒香梨（以下简称香梨）作为新疆地区特有品种，在生产上因缺铁造成的香梨果实变小，果实口味变差，大量减产甚至树体死亡等问题一直困扰着当地果农[1]。在花器官诊断和光谱分析等营养诊断技术还不成熟的条件下，用叶片诊断来指导果园施肥是一种常规有效手段[2-7]。许多年来，库尔勒香梨的缺铁诊断也和其他果树一样，采用单位叶干质量全铁含量这一指标来评价香梨树体铁营养状况。但是，在测定叶片全铁含量时，常常会遇到失绿黄化叶片的全铁含量与正常绿叶的全铁含量相差不多甚至比其高的现象，称之为“Iron Chlorosis Paradox（铁素黄化悖论）”[8-11]。因此，全铁含量不仅不能判断果树铁营养状况，还会给科研人员带来困扰。董慕新[12]对果树叶片有效铁进行了较为深入的研究，本研究在借鉴其结论的基础上，对库尔勒香梨叶片有效铁进行了测定。从结构角度来说：质外体是细胞膜以外，由细胞壁的纤维微晶空间及充满水分和空气的细胞间隙构成的空间。质外体在植物根、茎、叶等各个器官中均存在，在地上部呈连续体。从功能角度来说：质外体是植物进行养分吸收与运输，物质积累与转化，及微生物反应的空间，但关于叶片从质外体中获取矿质营养特别是铁的研究还较少[13]。笔者探索了库尔勒香梨叶片中铁可利用的主要形态和空间分布情况，在摸清叶片中铁的可利用形态和“铁库”位置的基础上，解除“铁素黄化悖论”给人们带来的困扰，以期在生产上为库尔勒香梨缺铁矫正做到有的放矢，提供理论支持。

1 材料和方法

1.1 试验材料

参照黎秀丽[14]的失绿黄化分级标准，2010—2013年从库尔勒地区英下乡、托布力其乡、沙依东园艺场、农科所等地，对供试的3级失绿黄化香梨树的上、中、下不同方向枝条上随机采取当年生新梢中部有代表性的2级失绿黄化程度叶片300片。在0级正常树上的上、中、下部枝条上随机取0级正常绿叶为对照样。

新鲜叶样的预处理：所采新鲜叶样应立即装入留有小孔的透明塑料袋中，放入盛有冰袋的泡沫保温箱中，24 h内带回实验室，用于含水量、叶面积和质外体铁含量的测定。

干燥叶样的预处理：所采叶样先用0.1%无离子洗涤剂溶液洗涤，然后用自来水冲洗两遍，最后用去离子水洗净，风干叶表水。置于透气性较好的纸袋里，放入鼓风干燥箱中。在105 ℃下杀青30 min，75 ℃鼓风干燥48 h至恒质量。干燥后的叶样用瓷研钵磨碎后，过0.4 mm孔径的筛，装于塑料瓶中待测。

1.2 测定项目及方法

1.2.1 全铁的测定 准确称取2.0 g磨碎处理后的样品3份，分别置于30 mL瓷坩埚中，放到盘式电炉焙烧炭化。稍凉后放入600 ℃马弗炉内灰化4 h，待凉后加入10 mL5%HNO3溶解，过滤至100 mL容量瓶中，适量热蒸馏水洗涤坩埚，KSCN检验有无残余铁，蒸馏水定容至100 mL。吸取20 mL样液放入对应50 mL容量瓶，加入4 mL10%盐酸羟氨，充分摇匀后静置5 min，再加入5 mL10%醋酸钠，2 mL0.1%邻菲啰啉显色，静置30 min后在530 nm处测其吸光度，并计算铁含量[15-16]。

1.2.2 有效铁的测定 称取1.0 g磨碎处理后的叶样3份分别置于50 mL容量瓶中，加入0.1 mol·L-1盐酸定容至50 mL，加盖静置浸提24 h后，分别过滤至50 mL洁净容量瓶中，吸取5 mL浸提液，加蒸馏水至20 mL，以后步骤同全铁含量测定。

1.2.3 香梨叶片质外体汁液中铁含量测定 先进行香梨叶片质外体汁液的提取。质外体汁液提取按文献[17-22]的方法进行。将新鲜叶片用去离子水洗净、擦干，称取叶片质量后，在负1个大气压的真空下向叶片渗入预冷的浓度为0.28 mmol·L-1山梨醇溶液，直到叶片颜色变深，表面有大量小气泡时为止，时间为5 min。然后取出叶片，吸干表面水分，将叶片放入特制离取装置中5 000×g（失绿黄化叶按4 000×g）速率离心10 min，离心温度控制在4 ℃以下。所收集的液体即为香梨叶片质外体汁液。

质外体汁液中铁含量测定的步骤为：先对离取的质外体汁液称质量，同时取相同质量的去离子水做空白对照，倒入100 mL锥形瓶中，加入30 mL浓高氯酸（分析纯）和浓硝酸（分析纯）（5∶1）混合酸置于盘形电炉上消煮，当液体透明时即可停止消煮。向消煮液锥形瓶内加20 mL蒸馏水，过滤至100 mL容量瓶中，再用10 g·L-1热盐酸洗涤锥形瓶内残渣，用50 g·L-1热盐酸洗净锥形瓶内3价铁（KSCN检验），温蒸馏水洗涤数次，定容至100 mL。吸取20 mL样液，其余步骤同全铁的测定[23]。

1.2.4 叶片含水量的测定 取采回的香梨正常和黄化叶片处理的鲜叶样20片，称量鲜质量（初试鲜质量），经105 ℃杀青30 min，75 ℃烘干至恒质量后称质量，计算叶片含水量[24]。

叶片含水量=[（初始鲜质量-干质量）/初始鲜质量]×100%

1.2.5 叶面积的测定 用纸质量法测香梨叶片叶面积，取其平均值。

2 结果与分析

2.1 不同表征方法表征香梨叶片全铁和有效铁含量的比较

“铁素黄化悖论”现象是在测算叶片全铁含量时发现的，由图1可知，在4个采样点，用单位叶干质量表征全铁含量时，沙依东和州农科所所采不同处理叶片全铁含量差异不显著，4组数据的平均值差异也不显著，这就出现了“黄化悖论”现象；其余2个采样点所采叶片全铁含量差异均极显著。用单位叶面积表征叶片全铁含量时，4个采样点正常绿叶和失绿黄叶叶片全铁含量差异均极显著。由图2知，当用单位叶干质量表征叶片有效铁含量时，还是有2个采样点不同处理叶片铁含量差异只是显著；当用单位叶面积表征叶片有效铁含量时，4个点所采不同处理叶片有效铁含量差异均极显著。综合4种表征方法来看，以单位叶面积为底数来表征全铁和有效铁含量可以避免出现“铁素黄化悖论”现象，可以此计算方法，通过大量测定对比，提出库尔勒香梨叶片铁含量诊断标准。

2.2 香梨失绿黄叶和正常绿叶单位叶面积质量和灰分率的比较

缺铁对香梨生长的影响是多方面的，通过对香梨叶片单位叶面积质量和灰分率分析，如表1所示，当用单位叶面积质量来区分缺铁失绿叶片和正常绿叶时，二者差异很大，采样试点及其均值的单位叶面积重量均呈极显著差异，说明缺铁严重影响了香梨叶片的正常扩展和干物质积累。在灰分率对比中，失绿黄叶均值为11.41%，而正常绿叶是9.13%，两者的差异亦极显著。由于灰分元素是从土壤中吸收的，这种灰分率的极显著差异表明黄化香梨叶片矿质元素的积累和代谢紊乱，而传统上以叶干质量为底数来表征叶片铁含量并不能表明这种差异[25]。

2.3 香梨黄化叶片和正常绿叶中质外体铁含量分析

由表2可知，在新鲜叶质量基础上表示质外体中铁的含量时，正常绿叶质外体中铁含量是29.85 mg·kg-1，约占全铁含量的58%；黄化叶片质外体中的铁含量约占对应全铁含量的64%。因离取的质外体汁液绝对量较少，加上未充分离取出的一部分，计算出的质外体铁含量会大于目前所得数值。如果以全铁含量减去对应的质外体铁含量就得到叶片能利用的铁含量，这部分铁数量要远远小于所对应的有效铁数量，表明质外体中有一部分铁可能是被还原的以2价态形式存在的。失绿黄叶中的质外体铁由于还原酶缺乏或者活力很弱无法还原足够量铁进入叶片生理代谢循环。失绿黄叶的含水量与正常绿叶比，方差检验差异性达到显著水平，失绿黄叶由于生理性缺素导致叶片营养器官功能降低，损耗了较多营养物质，无法积累到正常水平的干物质量供树体其余器官代谢，也导致了叶片含水量所占比例升高。

3 结论与讨论

根据笔者的试验分析，库尔勒香梨叶片表观黄化，以常规方法测全铁的量与正常绿叶比差异并不显著，有时甚至比正常绿叶全铁含量还高，表明这种缺铁并不是真正的缺乏铁元素，而是一种生理性缺铁。香梨叶片在铁绝对含量并不缺少的情况下，却表现出缺铁黄化症状，表明叶片中的铁有一部分以不可利用的方式被贮存。有效铁，又叫生理活性铁，常用0.1 mol·L-1盐酸浸提铁来定义 [26-28]。在本研究中，香梨黄化叶片的有效铁含量显著小于正常绿叶，以前笔者的试验和大量文献中也验证了有效铁含量和对应叶片的叶绿素含量的高度相关性[14]。但为何失活铁没被转化为有效铁，0.1 mol·L-1盐酸浸提的铁是不是全部有效铁，目前仍处在假说阶段，尚无统一的说法。笔者对香梨叶片质外体中铁的含量测定表明，无论是正常绿叶还是黄化叶片，很大一部分是聚集在质外体中。由于质外体是细胞壁组成的连续体，这种连续体是在细胞膜外，所以质外体铁可以理解为是附着在细胞壁之上的，这部分质外体铁可以看作是叶片的“铁库”。在正常叶片中，质外体铁库可以理解为为防止细胞内铁吸收过量而产生的一种解毒机制；在缺铁状态下，叶片中氢离子分泌增加还原力增强，质外体中的铁可以重新溶解被细胞吸收，从而抵抗短期缺铁[27]。而对于黄化叶片，有一种假说认为，土壤或培养液中高浓度HCO3-环境或者大量硝态氮（NO3-）肥的施加，使得叶片质外体中pH值升高，这种高pH值环境严重抑制了位于细胞质膜上的3价铁还原酶的活性，从而导致只有极少量的2价铁穿过细胞质膜进入到叶片共质体内被细胞利用，而使叶片缺铁黄化[9]。这些不能被利用的高价铁可能就会聚集在细胞质膜外，附着在细胞壁上。这样黄化叶片质外体铁含量就会升高，整个叶片铁浓度就会增加，也就会产生黄化叶片全铁含量有时比黄化叶片还要高的不可思议现象。

综上笔者认为，（1）库尔勒香梨叶片产生缺铁黄化的直接原因是缺乏有效铁，有效铁是叶片能利用的铁的主要形态，以叶干质量或叶面积为底数皆可以作为香梨铁素营养的表征量。（2）有些缺铁黄化的叶片全铁含量相比于正常绿叶并不低，说明缺铁黄化是一种生理性失调，以叶面积为底数的全铁含量可以表征香梨铁素营养状况，以叶干质量为底数虽然不能体现，但可以为矫正缺铁黄化的物质基础做出判断。（3）香梨叶片的铁库存在于质外体中，也就是说香梨叶片中铁的空间分布特征是质外体中占58%～64%多，共质体占一小部分，黄化叶片的质外体中的铁由于外部环境所致并没有被叶细胞吸收利用。

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