脑损伤后神经细胞凋亡变化及黄体酮保护作用的研究

张于++李云++裴斐++++周洪霞++++徐胜++董伟

[摘要] 目的 观察脑损伤后神经细胞凋亡变化及黄体酮的保护作用。 方法 雄性SD大鼠随机分为假手术组、脑损伤组和黄体酮治疗组，大鼠脑损伤模型制作是利用改良的Feeney自由落体损伤装置。各组于伤后24、48、72 h取材。用免疫组织化学法观察大鼠皮质和海马CA1区半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）的表达水平变化。 结果 脑损伤组的Caspase-3阳性细胞数在皮质和海马CA1区较假手术组显著增加，黄体酮治疗组与脑损伤组比较，Caspase-3阳性细胞数明显减少，差异有统计学意义（P<0.05）。 结论 黄体酮抑制脑损伤后Caspase-3的表达可能是黄体酮脑保护作用机制之一。

[关键词] 黄体酮；脑损伤；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3

[中图分类号] 651.1+5 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）11（a）-0012-03

脑损伤是严重危害人类健康和威胁生命的疾病之一。脑损伤后的继发性损伤以往认为主要是神经细胞水肿和坏死，近年发现创伤性脑损伤后存在10%～50%的细胞凋亡，而且主要存在于皮质和海马等部位。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）处于细胞凋亡过程中的关键地位，是细胞凋亡过程的最终执行者[1]，在脑损伤后各种病理因素作用下，Caspase-3被激活，通过作用于底物引起细胞凋亡。对脑损伤后的继发性损伤，目前尚无有效的治疗药物。近年研究发现，黄体酮（progesterone，PROG）作为一种神经甾体激素，在体内、体外等多种实验中已经证实具有脑损伤保护作用[2]，但PROG对脑损伤后细胞凋亡的影响存在争议。本实验通过建立Feeney自由落体大鼠脑损伤模型，利用免疫组织化学技术，探讨PROG对大鼠脑损伤后Caspase-3表达的影响，以阐明PROG对脑损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料及仪器

恒冷箱组织切片机，CM1900型，德国Leica公司；Olympus显微摄影装置，PM-10AD型，日本Olympus公司。PROG试剂，购自Sigma公司；Caspase-3一抗试剂，购自武汉博士德公司。

1.2 实验分组

雄性成年SD大鼠54只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，体重250～300 g。实验动物随机分为3组：假手术组18只、脑损伤组18只、PROG治疗组18只；每组又分为24、48、72 h 3个时间点检测细胞凋亡的变化。

1.3 动物模型

采用改进的Feeney自由落体方法建立大鼠创伤性脑损伤模型。麻醉采用10%水合氯醛腹腔麻醉，麻醉后切开头皮，打开直径5 mm的骨窗，其位置在矢状缝后1.5 mm，中线旁2.5 mm处；自由落体重锤质量40 g，从25 cm 处高度自由落下造成脑损伤。假手术组仅切开头皮，在相同位置开同样大小的骨窗。PROG试剂溶解于22.5% 2-羟丙基-β-环糊精溶质中，PROG治疗组伤后1、6 h腹腔注射PROG 16 mg/kg以利于快速吸收，接下来连续每天1次皮下注射。

1.4 免疫组织化学检测

分别于伤后24、48、72 h 3个时间点，对大鼠脑组织进行甲醛灌注，并且取材固定，自视交叉后做片厚5 μm的冠状切片待用。Caspase-3免疫组织化学检测采用SP法，按照免疫组织化学法说明书加入一抗和二抗等操作。切片在400倍光镜下观察，利用免疫组织化学CMIAS真彩色医学图像自动分析系统进行阳性细胞计数，以5个视野的平均值代表各区计数结果。

1.5 统计学处理

数据采用SPSS 16.0软件进行统计分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，采用方差分析，以P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

假手术组少见Caspase-3表达，脑损伤组伤灶周围皮质和海马CA1区，可见大量Caspase-3阳性细胞表达；与假手术组比较，脑损伤组的Caspase-3阳性细胞表达明显增高，差异有统计学意义（P<0.05）；黄体酮治疗组在损伤的周围皮质和伤侧海马CA1区Caspase-3表达与脑损伤组比较明显减少，差异有统计学意义（P<0.05）（表1）。

3 讨论

随着社会的发展，脑损伤患者逐年增多。发达国家的颅脑损伤年发生率高达（150～250）/10万人；我国颅脑损伤的年发生率为（100～200）/10万人，直接和间接经济损失高达数百亿元。脑损伤可以分为原发性损伤和继发性损伤，原发性损伤无法恢复；而继发性损伤通过钙超载、兴奋性神经递质的释放、脂质过氧化反应、自由基产生、炎症反应等多种因素加重脑损伤，进而影响神经功能[3-4]。其中细胞凋亡在继发性脑损伤中扮演重要角色[5-6]，Caspase是细胞凋亡事件的执行者，Caspase-3的激活通过作用于DNA修复蛋白、细胞骨架蛋白等裂解，最终发生细胞凋亡。

PROG对脑损伤后细胞凋亡的影响存在争议。Djebaili等[7]通过建立脑损伤模型，给予PROG干预，发现PROG可降低Caspase-3的活性。然而，Hoffman等[8]建立过敏性脑炎模型，利用TUNEL法检测细胞凋亡，结果显示PROG促进凋亡的方式；进一步有学者Garcia-Segura等[9]研究在雌激素条件下PROG对凋亡影响的实验中，结果显示下丘脑弓状神经元细胞凋亡增加，说明PROG对雌激素抗凋亡具有抑制作用。上述文献表明，PROG对创伤性脑损伤后神经凋亡的影响是非常复杂的，在不同的模型、不同的实验条件下作用效果都不一致。本实验利用自由落体脑损伤模型，研究了PROG对凋亡的影响变化，结果发现，创伤性脑损伤后24 h皮质和海马CA1区即有神经细胞凋亡，脑损伤后48 h神经细胞凋亡数量达到高峰，伤后72 h有所下降，证实了脑损伤后细胞凋亡的存在。给予PROG后，发现Caspase-3阳性细胞数明显减低，提示PROG抑制创伤性脑损伤后神经细胞凋亡可能是PROG脑保护作用机制之一。

有学者通过进一步研究显示[10]，PROG可能通过多种机制实现脑保护作用，例如抑制自由基的产生、减少兴奋性神经递质的释放、减少血-脑脊液屏障通透性、减轻炎症反应、抑制脑水肿、抑制钙超载、减轻脂质过氧化反应等多种生物学效应发挥神经保护作用。PROG脑保护作用的机制尚未完全清楚，近年发现PROG神经保护的作用模式，通过膜受体作用于第二信使，改变神经元的兴奋性或活化细胞内的信号转导通路发挥非基因效应[11]，而且，PROG作用速度快，副作用小，安全性好，易于通过血-脑脊液屏障，是一种非常有前景的脑损伤保护药物。

[参考文献]

[1] 姚丽峰，白莉.扁平苔藓皮损中IL-17、FoxP3和Caspase-3的表达及意义[J].中国当代医药，2014，21（5）：25-27.

[2] Deutsch ER，Espinoza TR，Atif F，et al.Progesterone′s role in neuroprotection，a review of the evidence[J].Brain Res，2013，1530：82-105.

[3] 张涛，张宇新，王振海，等.塞来昔布对重型颅脑创伤后运动功能的影响[J].中华实用诊断与治疗杂志，2011，25（12）：1188-1190.

[4] 张涛，张宇新.尼美舒利对大鼠重型颅脑创伤后学习记忆功能的影响[J].四川大学学报·医学版，2011，42（4）：498-502.

[5] 杨鹏，李云，朱军，等.神经节苷酯对大鼠弥漫性脑损伤后学习记忆功能的保护作用[J].中华实验外科杂志，2010， 27（6）：834.

[6] 杨鹏，李云，朱军，等.亚低温对大鼠弥漫性脑损伤后海马CA1区Apaf-1蛋白表达和学习记忆功能的影响[J].中华神经医学杂志，2011，10（7）：669-672.

[7] Djebaili M，Hoffman SW，Stein DG.Allopregnanolone and progesterone decrease cell death and cognitive deficits after a contusion of the rat pre-frontal cortex[J].Neuroscience，2004，123（2）：349-359.

[8] Hoffman GE，Le WW，Murphy AZ，et al.Divergent effects of ovarian steroids on neuronal survival during experimental allergic encephalitis in Lewis rats[J].Exp Neurol，2001， 171（2）：272-284.

[9] Garcia-Segura LM，Cardona-Gomez P，Naftolin F，et al.Estradiol upregulates Bcl-2 expression in adult brain neurons[J].Neuroreport，1998，9（4）：593-597.

[10] Stein DG.Is progesterone a worthy candidate as a novel therapy for traumatic brain injury？[J].Dialogues Clin Neurosci，2011，13（3）：352-359.

[11] Cooke PS，Nanjappa MK，Yang Z，et al.Therapeutic effects of progesterone and its metabolites in traumatic brain injury may involve non-classical signaling mechanisms[J].Front Neurosci，2013，7：108-119.

（收稿日期：2014-09-12 本文编辑：许俊琴）

有学者通过进一步研究显示[10]，PROG可能通过多种机制实现脑保护作用，例如抑制自由基的产生、减少兴奋性神经递质的释放、减少血-脑脊液屏障通透性、减轻炎症反应、抑制脑水肿、抑制钙超载、减轻脂质过氧化反应等多种生物学效应发挥神经保护作用。PROG脑保护作用的机制尚未完全清楚，近年发现PROG神经保护的作用模式，通过膜受体作用于第二信使，改变神经元的兴奋性或活化细胞内的信号转导通路发挥非基因效应[11]，而且，PROG作用速度快，副作用小，安全性好，易于通过血-脑脊液屏障，是一种非常有前景的脑损伤保护药物。

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[11] Cooke PS，Nanjappa MK，Yang Z，et al.Therapeutic effects of progesterone and its metabolites in traumatic brain injury may involve non-classical signaling mechanisms[J].Front Neurosci，2013，7：108-119.

（收稿日期：2014-09-12 本文编辑：许俊琴）

有学者通过进一步研究显示[10]，PROG可能通过多种机制实现脑保护作用，例如抑制自由基的产生、减少兴奋性神经递质的释放、减少血-脑脊液屏障通透性、减轻炎症反应、抑制脑水肿、抑制钙超载、减轻脂质过氧化反应等多种生物学效应发挥神经保护作用。PROG脑保护作用的机制尚未完全清楚，近年发现PROG神经保护的作用模式，通过膜受体作用于第二信使，改变神经元的兴奋性或活化细胞内的信号转导通路发挥非基因效应[11]，而且，PROG作用速度快，副作用小，安全性好，易于通过血-脑脊液屏障，是一种非常有前景的脑损伤保护药物。

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[7] Djebaili M，Hoffman SW，Stein DG.Allopregnanolone and progesterone decrease cell death and cognitive deficits after a contusion of the rat pre-frontal cortex[J].Neuroscience，2004，123（2）：349-359.

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[9] Garcia-Segura LM，Cardona-Gomez P，Naftolin F，et al.Estradiol upregulates Bcl-2 expression in adult brain neurons[J].Neuroreport，1998，9（4）：593-597.

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（收稿日期：2014-09-12 本文编辑：许俊琴）