PI3K/Akt/NF-κB通路调控ABCB1/P-gp介导的人结肠癌细胞多药耐药的研究

隋华 付晓伶 潘树芳 石晓兰 靳宝辉 朱惠蓉 任建琳 李琦*

1.上海中医药大学附属曙光医院肿瘤科，上海201203；

2.上海中医药大学附属普陀医院肿瘤科，上海200062；

3.上海市中医医院肿瘤科，上海200071

肿瘤细胞的多药耐药(multidrug resistance，MDR)基因的表达是肿瘤化疗失败的最常见而又最难解决的问题之一［1］，因其机制复杂，目前尚未得到有效解决。肿瘤细胞产生耐药性与多种因素有关，其中最主要的原因是ATP结合膜转运蛋白家族过表达诱发的细胞外排作用加强，细胞内药物浓度降低，从而引起肿瘤细胞对化疗药物的敏感性降低［2］。磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide 3-kinases，PI3K)信号通路参与肿瘤多药耐药的发生。近年来研究发现，PI3K/Akt信号转导通路在细胞增殖、分化、肿瘤的血管形成和转移等方面起着重要的作用［3-5］。有研究表明，PI3K/Akt信号转导通路的激活参与肿瘤多药耐药的发生、发展［6］，但是具体的调控机制尚不明确。本实验选用人结肠癌奥沙利铂耐药细胞株HCT-116/L-OHP及其敏感株HCT-116细胞，给予PI3K信号通路特异性的抑制剂(LY29400)干预，观察细胞的药物敏感性、相关耐药蛋白P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)、LRP、MRP-2以及PI3K/Akt信号通路上下游基因的表达变化，探讨PI3K/Akt信号转导通路对人结肠癌多药耐药细胞生物功能和耐药性的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞与试剂

人结肠癌细胞株HCT-116及人结肠癌耐奥沙利铂细胞株HCT-116/L-OHP购自上海博谷生物科技有限公司。细胞计数试剂盒8-(cell counting kit-8，CCK-8)试剂盒购自上海同仁化工有限公司；PI3K/Akt信号通路特异性的抑制剂LY294002购于美国Serologllcais公司；奥沙利铂50 mg(批号：H20000337)购于江苏恒瑞医药股份有限公司。总RNA抽提试剂RNAiso Reagent、定量PCR试剂购于日本TaKaRa公司；GAPDH和ABCB1基因上下游引物和探针由生工生物工程(上海)有限公司设计并合成。蛋白质抽提试剂盒(Sangon S-415)、BCA蛋白质定量试剂购自上海博谷生物科技有限公司；SDS-PAGE电泳试剂购自上海博彩生物技术有限公司；兔抗人P-gp、LRP、MRP-2、Akt、p-Akt、IκB、p-IκB单克隆抗体购自美国CST公司。

1.1.2 仪器

Mastercyclerep银 质 梯 度PCR仪、Biophotometer生物分光光度计、5804R高速冷冻离心机购自德国Eppendorf公司；CKX41/U-RFLT50荧光倒置显微镜购自日本OLYMPUS公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

HCT-116/L-OHP及HCT-116细胞于含10%小牛血清的RPMI-1640培养液(含青霉素、链霉素各100 U/mL)中，在37 ℃、CO2体积分数为5%、饱和湿度培养箱中常规培养。HCT-116/L-OHP细胞的奥沙利铂维持浓度为10 μg/mL，实验在停用奥沙利铂培养2周后取处于对数生长期的细胞进行。

1.2.2 用CCK-8检测细胞增殖情况

按照H CT-116细胞株敏感组，HCT-116/L-OHP细胞株耐药组，HCT-116/L-OHP+LY294002(20 μmol/L，2 h)分组，将各组调整至1×105/mL，以每孔100 μL接种于96孔细胞培养板中，在37 ℃、CO2体积分数为5%、饱和湿度培养箱中常规培养，待细胞贴壁后3～5 h后，除对照组外各自加入含不同浓度化疗药物的培养基100 μL，每组设4个复孔。培养48 h后每孔加10%CCK-8的培养基，培养箱内继续培养1.5 h后，于酶标仪检测450 nm波长处吸光度(A值)。计算细胞的生长抑制率、耐药指数(resistance factor，RF)和逆转指数(resistance index，RI)。计算公式：生长抑制率=(1- A实验组平均值/ A对照组平均值)×100%；RF=某种药物针对抗药性细胞的IC50/某种药物针对敏感性细胞的IC50；RI=不加逆转剂时某种药物针对抗药性细胞的IC50/加入逆转剂后某种药物针对抗药性细胞的IC50。实验重复3次。

1.2.3 蛋白质印迹法(Western blot)检测P-gp、LRP、MRP-2、Akt、p-Akt、IκB、p-IκB蛋白的表达

收集处于对数生长期细胞约2×106个/组，用预冷PBS洗涤2次，吸弃PBS，加入预冷的蛋白裂解液在冰上裂解0.5 h，14 000×g离心15 min，吸弃上清液；BCA分析试剂测定蛋白质浓度。50 μg总蛋白质在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中电泳，PVDF膜转膜，5%脱脂奶粉封闭非特异性抗体，然后分别加入各种抗体，按1∶1 000封闭，4 ℃过夜。次日用TBS/T洗膜3次，再加入HRP标记的二级抗体，置室温温育膜1 h，ECL显色。GAPDH作内参对照，分析灰度值进行计算灰度系数比。

1.2.4 染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation，ChIP)RT-PCR

按照EZ—ChIP试剂盒步骤，直接在细胞培养液中加入适量37%甲醛，致其终浓度为1%，37 ℃温育10 min，进行交联。用预冷的含1 mmol/L PMSF的PBS洗涤细胞，收集细胞至浓度为1×106个。4 ℃、3 000×g离心5 min去上清液，收集细胞后加入SDS裂解液重悬。超声破碎DNA后，4 ℃ 12 000×g离心5 min，取出20 μL样品作为阳性对照(Input)用于后续检测。其余近2 mL样品加入70 μL Protein A+G Agarose/Salmon Sperm DNA，于4 ℃缓慢摆动混匀30 min。于4 ℃，1 000×g条件下离心1 min，将上清液转移至新的2 mL离心管中，加入适量p65(NF-κB)、IgG单克隆抗体(阴性对照)4 ℃缓慢摆动混匀过夜。加入60 μL Protein A+G Agarose/Salmon Sperm DNA，于4 ℃缓慢摆动混匀60 min，以沉淀一抗识别的蛋白或相应复合物。于4 ℃，1 000×g条件下离心1 min，吸尽上清液后依次用如下溶液对沉淀进行洗涤，每次用1 mL的洗涤液5 ℃缓慢摆动洗涤3~5 min，随后于4 ℃，1 000×g条件下离心1 min，弃上清液。所获得的沉淀即可用于PCR扩增目的基因序列。

RT-PCR：沉淀加入250 μL洗脱缓冲液，Vortex混匀，室温摆动洗脱3~5 min，1 000×g离心1 min，取上清液，同样步骤再次洗脱取上清液，2次上清液混合共计约500 μL。500 μL上清液中加入20 μL 5 mol/L NaCl溶液，阳性对照的20 μL样品加入1 μL NaCl溶液，混匀。65 ℃加热4 h去除蛋白和基因组DNA之间的交联。PCR验证ChIP：提纯的DNA进行PCR分析，模板分别为无DNA对照、阴性抗体免疫共沉淀的DNA、阳性对照DNA(InputDNA)、阳性抗体免疫共沉淀的DNA。引物为针对ABCB1基因启动子的引物对(引物序列为顺义链：5’-CCACTCCTCCACCTTTGAC-3’；反义链：5’-ACCCTGTTGCTGTAGCCA-3’)。PCR产物大小为379 bp。热循环条件：95 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30个循环，72 ℃延伸5 min。反应结束后各取10 μL PCR产物在2%琼脂糖凝胶上电泳。

1.3 统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件包处理数据。各组数据采用±s 表示，两独立样本均数比较，采用独立样本 t 检验，多样本均数比较采用单因素方差分析，均数间两两比较采用SNK-q检验(Student-Newman-KeμLs法)，求出组间差异。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 人结肠癌HCT-116/L-OHP细胞对化疗药物敏感性的影响

奥沙利铂对H C T-1 1 6 细胞的半数抑制浓度(I C50)为(1 9.8 4±1.4 2)μ g/m L，奥沙利铂对H C T-11 6/L-O H P 细胞的I C50为(157.48±16.73)μg/mL，耐药指数为7.94，差异有统计学意义(P<0.01)。HCT-116/L-OHP细胞加入PI3K抑制剂LY294002(20 μmol/L)2 h后，奥沙利铂对其的IC50降至(53.68±3.18)μg/mL，逆转指数为2.93，与未加LY294002组比较，差异有统计学意义(P<0.01，图1)。提示抑制PI3K/Akt信号通路的激活可以增强人结肠癌HCT-116/L-OHP细胞对奥沙利铂的敏感性。

图1 LY294002对HCT-116/L-OHP细胞生存率的影响Fig.1 Effect of LY294002 on cell survival in HCT-116/L-OHP cells

2.2 人结肠癌HCT-116/L-OHP细胞对相关耐药蛋白P-gp、MRP-2、LRP表达的影响

Western blot检测结果显示，人结肠癌HCT-116/L-OHP耐药细胞的P-gp、LRP、MRP-2蛋白相对表达量均明显高于敏感细胞HCT-116(P<0.01)。将LY294002作用HCT-116/L-OHP后，P-gp的表达降低明显(P<0.01)，但是LRP、MRP-2的表达差异无统计学意义(P>0.05，图2)。

2.3 LY294002对人结肠癌HCT-116/L-OHP细胞Akt、p-Akt、IκB、p-IκB表达的影响

与敏感细胞HCT-116相比，人结肠癌耐药细胞HCT-116/L-OHP的p-Akt(Thr307)、p-Akt(Ser473)以及p-IκB蛋白的相对表达量均明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)。但是Akt和IκB蛋白的相对表达量差异无统计学意义(P>0.05)，提示PI3K/Akt/NF-κB信号通路在肠癌耐药细胞中处于激活状态。当HCT-116/L-OHP细胞加入LY294002后，p-Akt(Ser473)和p-IκB蛋白的表达下调，与HCT-116/L-OHP细胞相比，差异有统计学意义(P<0.01)。但是p-Akt(Thr307)没有受到LY294002的影响，与未加入LY294002的耐药细胞相比，差异无统计学意义(P>0.05)。提示阻断PI3K/Akt信号通路后可降低HCT-116/L-OHP耐药细胞p-Akt(Ser473)和p-IκB蛋白的表达，抑制p-Akt(Ser473)的磷酸化可以阻断p-Akt/p-IκB的信号传递(图3)。

图2 LY294002对人结肠癌HCT-116/L-OHP细胞P-gp、MRP-2、LRP表达的影响Fig.2 Effect of LY294002 on P-gp, MRP-2, LRP expression in HCT-116/L-OHP cells

图3 LY294002对HCT116/L-OHP细胞内PI3K/Akt/NF-κB信号通路的影响Fig.3 Effect of LY294002 on PI3K/Akt/NF-κB signal pathway in HCT-116/L-OHP cells

2.4 NF-κB对ATP结合蛋白亚家族1抗体(ATP-binding cassette sub-family B member 1，ABCB1)基因启动子的影响

CHIP—PCR结果分析显示，空白对照无扩增产物条带；阴性IgG抗体(阴性对照)沉淀所得DNA的扩增产物少，电泳条带最弱；用未经抗体沉淀的Input DNA(阳性对照)扩增的产物电泳条带最强；用NF-κB抗体沉淀所得DNA作为模板扩增出了ABCB1基因的条带，提示NF-κB能够与ABCB1基因在启动子区域相结合，启动ABCB1基因的转录程序(图4)。

图4 NF-κB对ABCB1基因启动子的影响Fig.4 Effect of NF-κB on ABCB1 promoter

3 讨 论

大量临床研究证实，大肠癌的多药耐药与ATP结合膜转运蛋白家族中的P-gp、MRP和LRP的过表达相关［7-8］。P-gp是相对分子质量为170×103的跨膜糖蛋白，由ABCB1基因编码，具有12个跨膜区和2个细胞内ATP连结点［9］。当肿瘤细胞长期接触抗癌药物时，ABCB1基因被诱导扩增，P-gp被大量表达，其ATP结合点上连接的ATP水解后释放的能量能将抗癌药物转移到细胞外，使细胞内蓄积药物减少，降低作用靶点部位的药物浓度，导致化学治疗的效果下降乃至消失。本课题组前期研究发现，P-gp的过表达与结肠癌HCT8/V细胞的多药耐药相关［10］，但是具体机制尚不明确。

近年来的研究表明，PI3K/Akt信号途径与肿瘤的多药耐药密切相关［11］。在PI3K信号转导途径中，当上游信号途径刺激细胞膜表面时，导致酪氨酸激酶自磷酸化或磷酸化其他底物后，可在细胞膜内表面产生PI3K结合位点，PI3K激活下游的Akt。活化的Akt可以通过磷酸化其473位的丝氨酸位点(Ser473)或者第307位苏氨酸位点(Thr307)，进而激活或抑制其下游靶蛋白从而介导细胞的增殖、分化、凋亡、迁移和细胞周期的调控。Jiao等［12］研究发现化疗药物能通过激活PI3K显著提高磷酸化的Akt水平，最终导致乳腺癌细胞对化疗药物耐药；进一步研究证实，阻断PI3K/Akt信号转导通路可导致P-gp蛋白表达下调，从而逆转多药耐药。此外，Abdul等［13］发现在耐药的结肠腺癌细胞HT29RDB中，PI3K-Akt信号途径的阻滞剂LY294002与多柔比星联合使用能够在MRP1介导的耐药机制中发挥治疗作用，可使细胞内多柔比星药物浓度增加3倍以上。但是，PI3K/Akt信号通路的激活是如何改变ABCB1基因的表达以及影响程度，目前都尚未明确。

作为PI3K/Akt信号通路下游的核转录因子，NF-κB是一种广泛存在于真核细胞内的基因多向性转录因子，可以激活多种细胞进程的基因转录，包括炎性反应、细胞增殖、分化及凋亡等［14］。典型的NF-κB以p50-p65异源二聚体组成，在大多数细胞的静息状态下，NF-κB与其抑制分子IκB-α结合存在于细胞质中［15］。当细胞受到外界信号(如脂多糖、特异的细胞因子)刺激时，PI3K/Akt信号通路上的Akt蛋白发生磷酸化，引起一系列连锁的酶促反应，促使下游IκB-α发生磷酸化而与NF-κB解离，NF-κB激活而移位进入细胞核内，与DNA上相应位点结合来发挥生物学效应。已有研究在鼠肝癌细胞中发现，NF-κB可以直接与ABCB1b启动子区-205至+42之间的序列(5'-GGGGAATTCC-3')结合，激活ABCB1b基因的转录、扩增，诱发P-gp的过度表达［16］。

本研究显示，应用PI3K/Akt信号通路特异性抑制剂LY294002后，奥沙利铂对HCT-116/L-OHP细胞的IC50由(157.48±16.73)μg/mL降至(53.68±3.18)μg/mL，说明阻断PI3K/Akt信号通路能降低细胞的耐药性，使HCT-116/L-OHP细胞的抑制率增高。进一步研究发现，LY294002可以降低HCT-116/L-OHP细胞P-gp的表达，提示PI3K/Akt信号通路可能是通过诱导P-gp的过表达，从而引起肠癌耐药的发生。Western blot检测结果显示，LY294002主要是通过抑制HCT-116/L-OHP耐药细胞p-Akt(Ser473)和p-IκB磷酸化的发生，提示相对于HCT-116敏感细胞，HCT-116/L-OHP耐药细胞中存在PI3K/p-Akt/p-IκB信号途径的异常活化。ChIP-PCR检测结果显示，NF-κB能够与ABCB1基因在启动子区域相结合，启动ABCB1基因的转录，引起P-gp的过表达。

综上所述，PI3K信号通路通过激活人结肠癌HCT-116/L-OHP细胞的p-Akt/p-IκB信号途径，促使NF-κB与ABCB1基因在启动子区域相结合，启动ABCB1基因的转录，引起P-gp的过表达。PI3K信号通路的抑制剂LY294002可能是通过阻断该途径，从而增强耐药细胞对化疗药物的敏感性，逆转肠癌多药耐药。

［1］SUI H, ZHOU S, WANG Y, et al.COX-2 contributes to P-glycoprotein-mediated multidrug resistance via phosphorylation of c-Jun at Ser63/73 in colorectal cancer ［J］.Carcinogenesis, 2011, 32(5): 667-675.

［2］YU M, OCANA A, TANNOCK I F.Reversal of ATP-binding cassette drug transporter activity to modulate chemoresistance: why has it failed to provide clinical benefit? ［J］.Cancer Metastasis Rev, 2013, 32(1-2): 211-227.

［3］FANG Y, XUE J L, SHEN Q, et al.miR-7 Inhibits tumor growth and metastasis by targeting the PI3K/Akt pathway in hepatocellular carcinoma ［J］.Hepatology, 2012, 55(6): 1852-1862.

［4］GUO H, GAO M, LU Y, et al.Coordinate phosphorylation of multiple residues on single AKT1 and AKT2 molecules ［J］.Oncogene, 2013.doi: 10.1038/onc.2013.301.

［5］郭崇勇, 柯卫锋, 宋科瑛, 等.PI3K/AKT通路参与调控乳腺癌多药耐药和侵袭转移的研究［J］.现代生物医学进展, 2012, 12(25): 4809-4812.

［6］SUI H, FAN Z Z, LI Q.Signal transduction pathways and transcriptional mechanisms of ABCB1/Pgp-mediated multiple drug resistance in human cancer cells ［J］.J Int Med Res, 2012, 40: 426-435.

［7］FIGUEIREDO L L, PINTAO M C, OLIVEIRA L C, et al.Determination of P-glycoprotein, MDR-related protein 1, breast cancer resistance protein, and lung-resistance protein expression in leukemic stem cells of acute myeloid leukemia ［J］.Cytometry B Clin Cytom, 2008, 74(3): 163-168.

［8］潘树芳, 隋华, 李琦, 等.microRNAs调控消化系肿瘤多药耐药的研究进展［J］.世界华人消化杂志, 2013, 21(19): 1834-1840.

［9］WARD A B, SZEWCZYK P, GRIMARD V, et al.Structures of P-glycoprotein reveal its conformational flexibility and an epitope on the nucleotide-binding domain ［J］.Proc Natl Acad Sci U S A, 2013, 110(33): 13386-13391.

［10］隋华, 周利红, 刘宣, 等.COX-2介导MDR1/P-gp调控人结肠癌细胞多药耐药的研究［J］.中国癌症杂志, 2011, 21(4): 241-246.

［11］张晔, 刘云鹏.PI3K/Akt信号转导通路与肿瘤多药耐药研究进展［J］.中华临床医师杂志, 2011, 5(2): 446-449.

［12］JIAO M, NAN K J.Activation of PI3 kinase/Akt/HIF-1α pathway contributes to hypoxia-induced epithelialmesenchymal transition and chemoresistance in hepatocellular carcinoma ［J］.Int J Oncol, 2012, 40(2): 461-468.

［13］ABDUL R, SERRA V, GYORFFY B, et al.The PI3K inhibitor LY294002 blocks drug export from resistant colon carcinoma cells overexpressing MRP1 ［J］.Oncogene, 2006, 25(12): 1743-1752.

［14］刘海楠, 陈雷, 高彦宏.NF-κB国外最新研究进展［J］.临床合理用药杂志, 2011, 4(4): 159-160.

［15］CHATURVEDI M M, SUNG B, YADAV V R, et al.NF-κB addiction and its role in cancer: ‘one size does not fit all’ ［J］.Oncogene, 2011, 30(14): 1615-1630.

［16］TAKADA Y, KOBAYASHI Y, AGGARWAL B B.Evodiamine abolishes constitutive and inducible NF-κB activationby inhibiting IκBα kinase activation, thereby suppressing NFκB-regulated antiapoptotic and metastatic gene expression, up-regulating apoptosis, and inhibiting invasion ［J］.J Biol Chem, 2005, 290(17): 17203-17212.