HEK293 PEAK瞬转快速表达抗体蛋白平台的建立

颜为海，赵清霞，陈红岩

(1.复旦大学生命科学学院，遗传工程国家重点实验室，上海 200433)2.上海药明康德新药开发有限公司，上海 200131;3.和卓生物科技(上海)有限公司，上海 200000)

靶向药物是根据肿瘤细胞中分子的生物学特征与正常细胞中分子生物学特征的区别而研发的药物，是随着当代分子生物学、细胞生物学的发展而产生的高科技药物.目前靶向药物，尤其是抗体类药物在当下社会已经得到广泛的认可和应用.抗体类药物具有特异性高、毒副作用小、均一性好、靶向明确等优点［1－2］.在各种疾病的治疗或临床试验中，特别是肿瘤的治疗中，已有多种抗体药物被应用，到目前为止，处于临床前和临床研究及开发的抗体类药物已有约500多种［3－7］.

随着抗体类药物在疾病治疗或临床试验中的应用，尤其是人源化抗体的应用以及噬菌体展示技术的出现，抗体类药物的兴起和发展将会成为疾病治疗的趋势，因此抗体类药物的高通量生产将成为必然.研发抗体类药物的机构和企业急需一个可以小规模高通量表达抗体蛋白的平台，而瞬时表达系统可在短时间内获得可供研究的抗体样品，在抗体药物研发的早期阶段非常适用.

作者驯化HEK293 PEAK细胞适应无血清悬浮培养，获得可供实验研究的细胞株，用一种聚合物PEI将抗体基因转入宿主细胞中表达出具有生物活性的抗体蛋白，成功建立无血清悬浮培养HEK293 PEAK细胞的瞬转快速表达抗体蛋白平台.

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 细胞与质粒

HEK293 PEAK细胞购自ATCC;表达载体:已构建好的抗体轻重链质粒由作者单位实验室赠送.

1.1.2 培养基与试剂

Gibco®FreeStyleTM293表达培养液购自Invitrogen公司;EX－cell培养液购自Sigma公司;PEI购自Sigma公司;蛋白质分子量标准品购自Fermentas公司.

1.2 方 法

1.2.1 HEK293 PEAK细胞无血清悬浮培养驯化

将HEK293 PEAK细胞采用EX－cell培养液和Gibco®FreeStyleTM293表达培养液两种培养液进行驯化培养，每天记录细胞密度，计算细胞活率，以及观测细胞生长状态的变化.将驯化好的HEK293 PEAK细胞采用有限稀释法在96孔板中筛选亚克隆，挑选并建立抗体瞬转表达工程细胞株.

1.2.2 抗体瞬转表达条件优化及抗体蛋白表达

将构建好的能够表达抗体Herceptin的轻重链表达载体(p－antibody－heavy chain和p－antibodylight chain)(作者实验室保存)，用转染试剂PEI转染到建立好的HEK293 PEAK瞬转表达工程细胞株中.实验中优化了转染试剂PEI与质粒DNA量的比例，将PEI与DNA(GFP表达质粒)的比例设置为1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1，然后进行转染，72 h 后在荧光显微镜下观察，计数表达 GFP 荧光蛋白的细胞数及转染细胞活率.在确定质粒与转染试剂PEI的比例后，将构建好的对照抗体轻重链的表达载体用PEI共转入瞬转表达工程细胞株HEK293 PEAK细胞中，每天记录细胞活率和活细胞数，每天离心收集上清液用ELISA检测抗体蛋白的表达量［8－12］.

1.2.3 抗体蛋白的纯化及活性的初步分析

将收获的细胞培养上清液经ProteinA层析柱一步纯化.首先用10倍柱体积的结合缓冲液(0.1 M Tris/0.15 M NaCl，pH 7.5)平衡层析柱，至 OD280＜0.02.然后将离心收集并经 0.22 μm 滤器过滤后的细胞上清液，泵入层析柱(速率为1 mL·min－1).上样完毕后再用结合缓冲液(0.1 M Tris/0.15 M NaCl，pH 7.5)平衡层析柱，至少 10 个柱体积，至 OD280＜0.02.最后加入洗脱缓冲液(0.1 M Gly/0.15 M NaCl，pH 2.8)，约10 个柱体积.用1.5 mL EP 管收集洗脱的样品，1.0 mL/管，每个 EP 管内需预先加入中和缓冲液(1 M Tris，pH 8.0)100 μL.测OD值，取OD值最高及OD值与最高值相差不到一个数量级的样品管，收集，合并.并用4% ～12%SDS－PAGE梯度蛋白电泳胶进行分析.将洗脱的抗体样品在PBS缓冲液中透析过夜后定量，分装冻存备用.

将纯化好的抗体蛋白进行还原和非还原SDS－PAGE胶分析;为了验证经过驯化的HEK293 PEAK细胞转染后表达的抗体蛋白是否具有生物学活性，采用基于CCK－8的细胞抑制增殖实验对收获的抗体蛋白进行生物活性初步分析.采用人乳腺导管癌细胞BT474作为癌症靶细胞，BT474为Her2高表达细胞，能与抗体 Herceptin 特异性结合［13－15］.将靶细胞铺在 96 孔板中，15 000 cells·well－1，设置 3 复孔，加连续稀释的不同浓度的抗体作用72 h后，加入CCK－8，孵育4 h后在450 nm处读取吸光值，测定细胞活力，确定抗体抑制肿瘤细胞的活性.

2 结果

2.1 HEK293 PEAK细胞在无血清培养基中的悬浮驯化培养

采用EX－cell培养液和Gibco®FreeStyleTM293表达培养液两种培养液对HEK293 PEAK细胞进行悬浮驯化培养.图1为HEK293 PEAK细胞在EX－cell培养液和Gibco®FreeStyleTM293表达培养液两种培养液驯化培养的生长变化情况.在EX－cell培养液中HEK293 PEAK细胞随着培养时间的增长，细胞活率逐渐下降，活细胞数增长缓慢;在Gibco®FreeStyleTM293表达培养液中HEK293 PEAK细胞随着培养时间的增长，细胞活率先下降后逐渐恢复，活细胞数在活率恢复后明显上升.结果表明HEK293 PEAK细胞更适合在无血清Gibco®FreeStyleTM293表达培养液中悬浮培养.

图1 用EX－cell培养液(A)和Gibco®FreeStyleTM293表达培养液(B)驯化的HEK293 PEAK细胞生长变化曲线Fig.1 The growth curves of HEK293 PEAK cells in EX－cell medium(A)and Gibco® FreeStyleTM293 expression medium(B)

2.2 抗体瞬转表达条件优化结果及抗体蛋白表达

将 PEI与 DNA 的比例设置为1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1，通过与 GFP 质粒的转染，转染 72 h 后在荧光显微镜下观察并统计表达荧光蛋白GFP的细胞数，计算转染效率和活率.如表1所示，当PEI∶DNA为2∶1时，转染效率以及细胞活率最为理想.抗体轻重链的表达载体用PEI瞬转入瞬转表达工程细胞系HEK293 PEAK细胞后，第6天后活率明显下降，蛋白表达量也在第6天达到最高，为75.9 mg·L－1.

表1 不同PEI与DNA的比例转染效率以及转染72 h后活率Tab.1 72 h post－transfection efficiency and cell viability with PEI and DNA in different proportions

图2为抗体重链和抗体轻链表达质粒图谱.图3为转染后细胞活率和活细胞数的变化以及每天的蛋白表达量.结果表明质粒与转染试剂的比例为1∶2时，转染效率最佳，瞬时转染到第6天，抗体表达量最高.

图2 抗体重链(A)及轻链(B)质粒图谱Fig.2 The plasmid maps of p－antibody－heavy chain and p－antibody－light chain(B)

图3 转染后细胞活率和活细胞数的变化以及蛋白的表达量Fig.3 The growth curves(A)and the antibody expression(B)of HEK293 PEAK cells after transient transfection

2.3 表达纯化抗体的纯度及活性初步分析

2.3.1 抗体SDS－PAGE凝胶电泳结果

瞬转表达的抗体蛋白经ProteinA一步纯化后，进行SDS－PAGE凝胶电泳分析纯度.如图4所示，非还原性条件得到一个条带，约为150 kD，与抗体分子量相符合;还原性条件得到2个条带分别为50 kD和25 kD，分别与抗体轻、重链的分子量相符合.

2.3.2 抗体活性分析结果

瞬转表达的抗体蛋白经ProteinA一步纯化后进行活性分析，基于CCK－8的细胞抑制增殖实验，15 000 cells·well－1，加抗体作用72 h后，加入CCK－8测定细胞活力，图5为表达纯化的抗体蛋白和对照抗体Herceptin所做的活性分析结果.

图4 抗体蛋白SDS－PAGE结果Fig.4 The SDS－PAGE gel result

图5 抗体蛋白活性分析结果Fig.5 The biological activity of antibody

由图5可知，对照抗体抑制肿瘤细胞增殖的IC50=0.138 3 μg·mL－1，表达的检测抗体抑制肿瘤细胞增殖的IC50=0.151 2 μg·mL－1，二者抑制瘤细胞增殖活性在检测误差范围内，从图中可以看到瞬转表达的抗体蛋白与对照抗体Herceptin的活性基本相当，表达抗体的生物活性符合要求.

3 讨论

现在抗体药物发展飞速，能够快速获得具有治疗价值的抗体，并对其进行有效性和安全性评价的前提就是获得表达的抗体蛋白.瞬时转染技术由于目的基因不需要整合到宿主的基因组中，基因拷贝数和转染效率均相对稳定，可在短时间内获得可供研究的抗体样品，从而在抗体药物研发的早期非常适用.

瞬时表达常用的转染试剂为PEI，是一种阳离子聚合物，是近年发展迅速的高效非病毒载体之一，具有经济实惠、转染效率高、细胞毒性低、转染方法操作简单、转染的重复性好等优点，培养基可含或不含血清，可以用PBS或不含血清的培养基稀释DNA进行转染，转染过程中不需换液，适用于大多数常用细胞系.

目前用于抗体表达的工程细胞株主要有CHO、BHK、Vero、HEK293等［16］，这些细胞株大多数更适合稳转表达抗体.稳转表达虽然产量高，但耗时太长，不适合高通量小规模表达抗体.而HEK293 PEAK细胞为野生的HEK293 PEAK细胞稳定转染表达了SV40 T抗原以及EBNA1(Epstein－Barr nuclear antigen)蛋白，可以分别在宿主细胞内复制含有SV40复制子和EBV(Epstein－Barr virus)复制子的质粒［17－18］，这样可以大幅度提高瞬转的表达量，而且适用各种蛋白的不同表达方式.HEK293 PEAK细胞生长快，贴壁不牢，可以在无钙离子环境下生长，易于驯化为可无血清悬浮培养.

将HEK293 PEAK细胞驯化为无血清培养基中悬浮培养利于瞬转蛋白表达，而且培养基中不含血清，从而减化后期纯化工艺.国外商业化的工程细胞株均有专利保护，使用价格昂贵，作者成功驯化建立一株适合抗体研究的无血清悬浮培养的HEK293 PEAK细胞株，瞬转后表达量达到75 mg·L－1，可以满足后续抗体分析研究的需求，成功建立了成本低廉、快速高效、便于操作、方便抗体高通量瞬时小规模表达的平台.

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