海产品中副溶血性弧菌检测方法研究进展

刘雪飞，申越，任园园，张德福，李秀霞，励建荣

（渤海大学化学化工与食品安全学院，渤海大学食品科学研究院，辽宁省食品安全重点实验室，辽宁锦州 121013）

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，V.p）是一种革兰氏阴性嗜盐菌，是海水和江河口环境中的固有微生物。它能通过食物和水引起人类的疾病，同时也对生长在海水和江河口环境中的动物有致病性，包括养殖的动物[1]。V.p广泛存在于各种海产品中，鱼体带菌率约为 20%～90%[2]。一般情况下，海产品体内外均带菌，但当海产品作为食品被捕捞后，体外菌体迅速死亡，体内的副溶血性弧菌会很快感染整个海产品。我国食源性疾病监测网统计的数据显示，V.p是上报的食源性疾病暴发事件的首要致病因素。该菌在沿海地区已成为引起细菌性食物中毒的首要食源性致病菌[3,4]。其导致1996年以来世界范围沿海国家约50%以上细菌性食物中毒事件的爆发[5]。中国水产品出口国主要集中在日本、美国、欧盟和韩国，仅这四大市场就占到了总出口量的85%左右[6]。而这四个国家对进口水产品的安全要求中都明确规定副溶血性弧菌等致病菌一律不得检出。对原产自中国的进口水产品强制性要求进行V.p检测，检测结果为阳性时产品将被就地销毁，这给我国水产品的出口设置了贸易壁垒。

现阶段的研究认为，副溶血性弧菌产生的致病因子有多种，包括溶血素、尿素酶、粘附因子、第三分泌系统[7]等。研究较多的是溶血素类，其中耐热直接溶血毒素（thenmostable direct hemolysin,TDH）和耐热相关直接溶血毒素（TDH-related hemolysin, TRH）被认为是 V.p 的主要致病因子，分别由相应的tdh和trh基因编码。但其致病的详细机理尚不明确[4]。为了减少我国食品在进出口贸易中的经济损失，消除消费者的食品安全隐患，本文就现下流行的检测方法进行总结归纳，以便为检测方法的应用和发展提供参考。

1 传统的培养检测法

传统培养法即国家标准、行业标准等，被认为是食品检测的“金标准”，其最大的缺点是周期长（4～7d）、工作量大，但却是最经典的检测方法，可作为其他方法的验证。

目前认为微生物在自然界存在 4种生理状态：一是可培养的活菌，二是活的非可培养状态（VBNC），三是具有完整结构但无生物活性的死菌（Ghosts），四是细胞膜损伤死菌（Membrane compomised）[8]。传统培养法只能检出第一种，而进入VBNC的V.p在添加营养物质（25℃）和升温（37℃）条件下可以复苏，并检测出与标准菌株一致的毒力基因[9]。加之样本中的杂菌会产生竞争性抑制作用，从而使在食品样品上污染数量较少的V.p出现漏检的情况。例如窦勇[10]在利用ELISA法进行V.p检测时以国标法作为对照，实物样品中V.p低于105MPN/g时国标法就无法检出。

2 显色培养基法

显色培养基是在生化反应的基础上开发的技术，利用鉴别性培养基的原理，向分离培养基中加入细菌特异性酶的显色底物，以达到只须用肉眼辨别颜色就能方便地从近似的菌落中找出目的菌落的目的。检测结果直观，易于观察，减少了进行纯培养和生化鉴定的步骤，大大提高了检测效率[11]。且具有成本低、特异性强、灵敏度高和检测快速、操作方便等优点，是国内外微生物检测的一个主要发展方向。

传统检测方法中，国内外最常用的分离平板是硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖 （TCBS） 琼脂，该培养基针对V.p不发酵蔗糖的特点并结合酸碱指示剂进行显色，使V.p的菌落呈现绿色。但是TCBS不能有效区分生化特征相似的V.p、创伤弧菌（Vibrio vulnificus）、拟态弧菌（Vibrio mimicus）等，造成检测结果的不确定性。当有发酵蔗糖产酸的弧菌存在时，黄色菌落由于颜色扩散往往能覆盖绿色菌落，使V.p不易辨认[11-12]。因此许多国家都在致力于显色培养基的开发[11-15]，以弥补TCBS的缺陷。2008年我国修订了食品中副溶血性弧菌的标准检验方法[16]，首次将显色培养基引入我国的食品卫生标准。同年，张淑红等研制出了V.p显色培养基HKC vibrio，该培养基比TCBS具有更高的检测效率，可直接对V.p进行分离鉴定[11]。2010年，广东环凯微生物科技有限公司开发出具有自主知识产权的双酶底物复合显色培养基（HKMVPM），与国外的同类产品KHVPM和TCBS进行比较，结果显示对天然污染样品的V.p分离率由高到低的顺序为HKMVPM >KHVPM > TCBS[14]。显色培养基具有省时、低成本、高检出等特点，适合我国国情，必将会促进该项技术在我国得到广泛的应用与发展。

3 免疫学方法

3.1 酶联免疫吸附法（ELISA）

ELISA是最常见的免疫学检测方法，该方法实现了在细胞水平上对抗原或抗体的示踪，或在微克、甚至纳克水平上对抗原（致病菌）或抗体的定量。1993年，Romesranel B等人[17]建立了海产品中副溶血性弧菌的ELISA检测方法。在国内外的学者[18-21]对ELISA法逐渐改进的基础上，此项技术已日趋完善，现在市场上已经有了商品化的试剂盒产品，操作简单，特异性好，灵敏度高，并已广泛应用于病原性海洋弧菌的快速检测。

Kumar BK[18]等人的研究结果显示，样品被增菌16小时之后ELISA法可以检测到103以上的V.p细胞，较PCR法低两个数量级，但是通过检测分泌蛋白可以排除死细胞的干扰。而Sakata J[19]等人得出的结果是ELISA法可以检测少于100 MPN/g的V.p细胞，前提是需要进行前期的筛选，但总的检测时间可以在24h内完成。

3.2 免疫层析试纸条技术

该技术是20世纪80年代初发展起来的，因其具有简便、快速、廉价、适应性广等优点，可用于基层单位对各种食源致病菌的快速筛查检测。依据反应时抗原与抗体结合方式的不同，主要可将其分为双抗夹心免疫层析法和竞争免疫层析法两类[20]。双抗夹心免疫层析法是目前免疫层析试纸条检测食源性致病菌的主要方法。与竞争免疫层析法相比，双抗夹心免疫层析法主要用于大分子蛋白质、病毒、致病菌等带有多个抗原表位的大分子抗原的检测。而对兽药残留、违禁药物等小分子抗原检测中则多采用竞争免疫层析法[20]。免疫学方法是以抗原抗体反应为基础对待检物进行检测，如何提高抗原抗体的亲和力是提高免疫学检测方法的关键，也是其研究发展的方向之一。我国学者孔繁德等开展了这方面的研究[21]，试验过程仅需5～15min，对V.p的最低检测量为104CFU/mL。这种试纸条操作简便快速，特别适于基层的养殖部门和检查部门应用。

4 分子生物学方法

4.1 PCR技术

PCR(Polymerase Chain Reaction)即聚合酶链式反应，是Kary Mullis在1985年时发明的一种在体外扩增特异DNA片段的分子生物学方法。该方法一经问世,即引发国内外广泛关注，主要原因是其具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时、对标本的纯度要求低、不需要分离细菌等特点，因此在国内外被研究人员广泛应用于V.p的检测。PCR反应的成分主要有六种即引物、Taq DNA聚合酶、dNTPs、模板、Mg2+和反应缓冲液。

4.1.1 常规PCR

在检测致病性 V.p时，常选择引起致病性的毒力基因来设计引物进行扩增。这些毒力基因主要包括tdh基因[22-24]、trh基因[23-24]、毒力操纵子调节基因toxR[24-25]、编码促旋酶的gyrB基因[26-28]等。日本的标准推荐使用tdh和trh基因进行PCR检测。但是，tdh基因、trh基因都不是独立基因，造成它们与其他致病菌的毒素基因同源性很高，而且不是所有的V.p都含有 tdh 或 trh 基因，因此应用tdh或trh进行PCR检测存在很大局限性。如果要进行副溶血性弧菌的预防性检测，则推荐采用其属特异性基因tlh来设计引物。如王豪[29]和刘琦[30]等，其针对tlh基因设计引物对V.p检测，灵敏度为102～103CFU/ml，检测周期10h[30]。

4.1.2 多重PCR

多重PCR在致病菌检测时可同时检测多种致病菌，与单个PCR相比减轻了很大的工作量。当选用副溶血性弧菌种特异性基因tlh与其毒力基因进行多重PCR检测时，不但可以一次将V.p检出，而且可同时判断其检测到的V.p的致病性，这使该方法具有非常大的发展空间。

在日本、美国、加拿大等国的食品检测机构都推荐采用多重PCR法检测副溶血性弧菌，不同的只是他们针对的基因不同。这三个国家推荐采用多重PCR法检测副溶血性弧菌的基因分别为tdh和trh基因（日本）、tlh、tdh和trh基因（美国）、tdh、trh和R72H基因（加拿大）。加拿大食品检验属认为R72H基因不仅是V.p的毒力基因，而且具有高度的序列保守性，它还能将近缘的副溶血性弧菌和溶藻弧菌加以区分[31-36]。Rosec JP[35]等对不同基因设计引物来检测V.p时发现，不同的基因引物检测限有所不同。针对toxR 基因的扩增检测范围是 7～24 pg /反应管（提纯的DNA），而针对R72H基因进行扩增时检测范围变成了0.7 pg～10.6 ng/反应管（提纯的DNA）。

由于多重PCR体系更复杂，与简单PCR相比需要花费更多的时间去摸索稳定的体系，以及更要避免引物之间形成二聚体，干扰实验结果。

4.1.3 实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR（Real-Time PCR），是通过荧光强度变化监测产物量的变化。按照使用的荧光物质不同，将其分为探针类和荧光染料类两种。Robert-Pillot A等采用了荧光探针对虾内污染的V.p进行检测，当对象是提纯的DNA时，200 pg以上的含量都可以检测到。而在对对虾样品进行检测时，6h的前增菌可以将检测限提高3个数量级[37]。荧光染料的特异性没有探针法高，但是其价格相对低廉而且操作起来简单易行，因此有很多实验室一直沿用该方法。例如Kang MH等就运用荧光染料SYBR GreenⅠ对V.p 进行了检测，而且他们将定量PCR反应由3步缩短成了2步，PCR反应时间在6 min 之内就可以完成，检出限为100 fg的DNA[38]。

PCR检测方法本身存在一定的缺陷：一是细胞死后其DNA不能快速降解，导致环境DNA污染而出现假阳性结果；二是食品中很可能存在对PCR反应起抑制作用的物质而出现假阴性结果；三是这种分子检测方法需要价格昂贵的PCR仪，不适于基层推广应用。在运用PCR方法进行实物检测过程中，要注意避免样品中的外源DNA污染和杂质对PCR反应的干扰作用[31,39]。

4.2 环介导等温扩增（LAMP）技术

LAMP（1oop—mediated isothermal amplification）是 2000 年时由日本学者 Notomi 等发明的新型核酸体外扩增技术[40]。由于该方法不需要使用昂贵的PCR仪，检测成本低，反应的时间较PCR进一步缩短（1h以内），特异性更强，因此该方法被越来越多的检测实验室所采用[41-43]。因其易于在基层推广应用，有望成为未来的常规检测手段。

LAMP与PCR相比除了酶有变化外，其反应成分多了两条内引物，因此体系更复杂，实验结果重复性相对较差，需要实验者不断摸索稳定的反应体系，才能对实际样品中的副溶血性弧菌等致病菌进行准确检测。LAMP反应的副产物焦磷酸镁沉淀用肉眼不易观察，需采用专门的实时浊度仪跟踪反应进程。针对以上的缺点，刘威[44]和Wang X[45]将荧光染料羟基萘酚蓝（HNB）与LAMP相结合，通过观察扩增后反应管的颜色就可对实验结果进行判定，使操作更加简便，应用前景广阔。刘威等报道的LAMP 方法的最低检出限为 9.74 pg/ L，比PCR 方法的最低检出限高出一个数量级，反应可以在50 min内完成[44]。如果在反应体系中添加环引物，可以缩短一半的反应时间。

4.3 其他分子生物学检测方法

除了前面提到的方法外，分子生物学检测技术还包括DNA杂交法、DNA指纹图谱技术。在检测副溶血性弧菌时，DNA杂交法常常针对tdh等毒力基因设计特异性寡核苷酸探针，该探针需要预先附着放射性物质，当探针与靶序列结合后，通过放射性自显影进行结果观察，以达到指示目标基因的目的。

DNA指纹图谱是利用限制性内切酶对DNA进行特定位点的切割，从而获得不同长度的片段，再通过电泳将其分散而形成独特的条带。目前对副溶血性弧菌的 DNA指纹研究分别针对染色体DNA和质粒DNA。指纹图谱既能区分不同血清型又能对不同的副溶血性弧菌克隆进行鉴别，因此，该项技术在分子流行病学研究中应用非常广泛[31]。

5 其他方法

Raghunath P等[46]对V.p的富集方法进行了改进，运用其研制的富集培养基sodium taurocholate（ST broth）与传统培养法的碱性蛋白胨水（APW）进行对比试验，结果无论是传统的培养法还是PCR检测，ST的检出率都明显高于APW。陈伟鑫等[47]在GB / T4789.7－2003的基础上对其进行改进，通过同时用改进法和国标法对采集的193 件食品样品进行副溶血性弧菌检测，改进法检出率5.70%高于国标法的0.52%，两者有显著性差异。

另外，PCR方法可与其他方法相结合演变出许多新方法。如免疫捕捉PCR（IC-PCR）、膜过滤PCR和免疫磁珠PCR（IMS-PCR）等。还有的研究者利用特异的噬菌体对特定细菌有裂解的功能，从而对致病菌进行鉴定。但实验前需要对噬菌体进行筛选，而且必须同时进行生化鉴定才能确认[31]。

6 结语

随着副溶血性弧菌引起的食源性疾病数量的增加、范围的扩大，以及国内外学者对其研究的不断深入，其检测技术必将会得到不断改进和发展。而快速、高效、准确、简便的检测方法是今后的研究方向。在具体检测中，首先应该明确各种分析检测方法的适用范围及精确度，根据不同的研究目的采用不同的方法，或将几种方法综合运用，以避免方法本身不可避免的局限性，从而获得更加全面和更加可靠的信息。

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