喉癌组织中胃蛋白酶表达的初步研究

龚霞 秦永 王晓云 杨丽 孙铭君 杜俊 张伟

1 北京大学第一医院耳鼻咽喉头颈外科（北京 100034）；2 卫生部北京医院耳鼻咽喉科；3 卫生部北京医院病理科

咽喉反流（laryngopharyngeal reflux，LPR）是指胃内容物反流至食管上括约肌以上部位，包括鼻咽、口咽、喉咽等部位，可引起一系列症状和体征。临床研究发现，咽喉反流可导致喉后部炎症、咽炎、喉接触性肉芽肿等多种喉部良性病变。最近，咽喉反流被认为可能是喉癌发生的重要致病因素之一［1，2］，但也有研究不支持此观点［3，4］，故咽喉反流与喉癌是否相关也成为了研究的热点。由于咽喉反流缺乏客观准确且被广泛认可的诊断方法，也导致了相关研究的困难性和结果的差异性。最新的研究指出，喉部胃蛋白酶表达水平是诊断咽喉反流的一种有效、客观、可靠的检测方法［5］。为此，本研究拟通过分析喉癌患者喉部肿瘤组织标本中的胃蛋白酶表达，并与正常声带组织其表达对比分析，以初步探讨咽喉反流与喉癌的相关性。

1 资料与方法

1.1 喉癌与正常喉组织标本的收集 选取2011年1月～2013年12月期间，首诊于北京大学第一医院耳鼻咽喉科并经病理确诊为喉鳞状细胞癌的手术患者的喉癌组织标本32例作为喉癌组，排除喉癌复发患者、头颈部曾接受过放射治疗和／或化疗的患者；其中，男29例，女3例，年龄40～86岁，平均64.81±11.40岁；声门上型8例，声门型22例，声门下型2例。取2011年1月至2014年3月期间，在该院进行尸检的喉部正常者声带组织标本19例作为正常组，排除有咽喉部肿瘤病史、头颈部接受过放射治疗和／或化疗者；其中，男16例，女3例，年龄39～86岁，平均66.95±12.62岁。所有尸检标本均在死亡后6小时内取材，均有家属签署的尸检同意书。

1.2 免疫组化染色检测喉癌组及正常组组织标本胃蛋白酶表达水平 喉癌组肿瘤组织标本及对照组正常声带组织均在同一批次、同一条件下采用Maxvision两步法免疫组化方法检测喉粘膜内胃蛋白酶的表达，一抗为兔抗人胃蛋白酶多克隆抗体（uscnlife，产品编号为P3635Rb－h，1：75稀释），二步法试剂盒为迈新公司抗兔／鼠通用型免疫组化检测试剂盒（产品编号KIT5030）。以磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作阴性对照，以胃粘膜主细胞作为阳性对照。

免疫组化染色组织中胃蛋白酶显色强度参照Formwitz评分方法，根据显色深浅及阳性细胞的百分率（每片随机观察5个高倍镜视野，对其中的阳性细胞进行计数）分级。按鳞状上皮细胞或鳞状细胞癌细胞的胞浆显色深浅评分，无显色为阴性记0分，浅褐色为弱阳性记1分，棕褐色为阳性记2分，颗粒状深棕褐色为强阳性记3分；按显色组织的比例评分：显色＜25%为1分，显色25%～50%为2分，显色51%～75%为3分，显色＞75%为4分。根据二者的乘积将显色程度分为4级，0分为阴性记0级，1～4分为弱阳性记1级，5～8分为阳性记2级，9～12分为强阳性记3级。

1.3 统计学方法 因胃蛋白酶免疫组化评定结果为等级资料，故使用SPSS16.0软件采用卡方（χ2）检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组标本胃蛋白酶表达阳性率比较 喉癌组标本胃蛋白酶表达强阳性4例（12.5%，4／32），阳性10例（31.25%，10／32），弱阳性14例（43.75%，14／32），阴性4例（12.5%，4／32）。正常组标本胃蛋白酶表达无强阳性及阳性，弱阳性4例（21.05%，4／19），阴性15例（78.95%，15／19）。喉癌组胃蛋白酶表达的阳性率高于正常组，差异有显著统计学意义（χ2＝24.181，P＜0.001）。

2.2 两组标本免疫组化染色结果 喉癌组有4例鳞状细胞癌细胞浆大面积颗粒状深棕褐色的强阳性表达，14例鳞状细胞癌细胞浆较大面积棕褐色的阳性表达，而正常组无强阳性及阳性表达病例。此外，正常组有15例、喉癌组有4例鳞状上皮细胞或鳞状细胞癌细胞浆呈淡蓝色的阴性病例；而正常组有4例、喉癌组有14例鳞状上皮细胞或鳞状细胞癌细胞浆呈面积不等浅褐色的弱阳性病例（图1）。

图1 喉癌组织及正常声带组织中胃蛋白酶的表达（×200）

3 讨论

喉癌是一种多因素致病的肿瘤，吸烟与饮酒已被证实是喉癌发生的两大主要危险因素，但是随着全世界对吸烟饮酒两大危险因素的控制，喉癌的发病率并未下降，反而略有上升［6］。Gabrie 1960年首次提出，反流性胃食管炎可能是喉癌发生的一种危险因素；随后，Glanz 也指出胃内容物反复地刺激喉部是导致咽喉部粘膜组织发生恶变的原因；随着对咽喉反流性疾病的认识及深入研究，学者们进一步提出咽喉反流性疾病可能是喉癌的一个致病因素。然而，另一些相关研究结论并不一致，而咽喉反流缺乏客观、有效且广泛认可的诊断方法，可能是造成相关研究结果迥异的重要原因之一。24小时联合食管多通道腔内阻抗－pH监测［8］虽被认为是诊断的LPR金标准，但由于检查费用昂贵、有创且患者难以耐受、误差率高等不足，临床应用并不广泛。近年来，食管外胃蛋白酶检测，已逐渐发展为评估咽喉反流的指标［5］，其包括唾液或痰液胃蛋白酶及喉粘膜胃蛋白酶检测，但要准确取到咽喉反流患者含有胃蛋白酶的痰液标本较困难，易造成假阴性。

免疫组化染色法是临床最常用的组织病理学诊断方法，经济、迅速、客观、准确。本研究采用该方法检测到喉癌组胃蛋白酶表达的阳性率明显高于正常组，说明喉癌与咽喉反流有相关性。胃蛋白酶是一种仅由胃粘膜主细胞分泌的蛋白水解酶，在胃食管外任何部位检测到胃蛋白酶意味着胃内容物反流至该部位，而反流的胃内容物对咽喉部粘膜的损伤过程中，胃蛋白酶被认为起主要的作用，这也是目前研究的热点［5］。喉粘膜上皮细胞可通过受体介导的细胞内吞噬作用摄取胃蛋白酶［9，10］，Johnston［11］发现胃蛋白酶在非酸性环境下也能损伤咽喉粘膜上皮细胞，它能使咽喉上皮细胞中线粒体和高尔基复合体受损，具有细胞毒性以及明显改变多基因表达水平。随后，他还发现在非酸性环境下，胃蛋白酶能影响27个喉粘膜上皮致癌基因的表达及22个与头颈肿瘤有关的 microRNA 的表达［12］。Kelly［13］也提出长期的胃蛋白酶暴露，即便在非酸性的环境下，也会对喉粘膜上皮细胞的癌变及转移有促进作用。结合本研究结果，提示咽喉反流中被喉粘膜上皮细胞摄取的胃蛋白酶在非酸性环境下对喉粘膜的损伤可能是导致喉癌发生的另一个重要致病因素。值得注意的是，本研究中正常组也有4例标本出现了胃蛋白酶的弱阳性表达，说明这4例也存在咽喉反流的可能，进一步说明喉部正常者也存在咽喉反流现象，但是否会导致病变的发生，可能与反流的程度、次数以及是否合并吸烟、饮酒等多因素有关。由于本研究为初期研究，不足之处在于并未纳入其他相关因素，今后将结合多因素研究进行深入探讨。

总之，喉癌组织中胃蛋白酶阳性表达率明显高于正常声带组织，提示咽喉反流可能与喉癌存在着相关性，可能是喉癌发生的危险因素之一，提示对喉癌患者可进一步行胃蛋白酶检测，对阳性或强阳性结果的患者可在手术＋放化疗综合治疗的基础上进行辅助PPI治疗，以降低该危险因素，可能可以达到降低肿瘤复发的目的。

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10 Johnston N，Wells CW，Blumin JH，et al.Receptor－mediated uptake of pepsin by laryngeal epithelial cells［J］.Ann Otol Rhinol Laryngol，2007，116：934.

11 Johnston N，Wells CW，Samuels TL，et al.Pepsin in nonacidic refluxate can damage hypopharyngeal epithelial cells［J］.Ann Otol Rhinol Laryngol，2009，118：677.

12 Johnston N，Yan JC，Hoekzema CR，et al.Pepsin promotes proliferation of laryngeal and pharyngeal epithelial cells［J］.Laryngoscope，2012，122：1 317.

13 Kelly EA，Samuels TL，Johnston N.Chronic pepsin exposure promotes anchorage－independent growth and migration of a hypopharyngeal squamous cell line［J］.Otolaryngol Head Neck Surg，2014，150：618.