活血温肾方防治肝纤维化大鼠的实验研究

王 秀 严艳欣

（安徽省皖南医学院中西医结合研究中心，芜湖241001）

活血温肾方防治肝纤维化大鼠的实验研究

王 秀 严艳欣

（安徽省皖南医学院中西医结合研究中心，芜湖241001）

目的 探讨活血温肾方对肝纤维化大鼠的防治作用及作用机制。方法 采用四氯化碳肝纤维化大鼠模型，随机分为五组：正常组、模型组及三个用药组 （温肾组、活血组、合用组），用药组分别予以温肾方、活血方、合用方 （温肾方+活血方）灌胃，连续用药4周后，ELISA法测定大鼠血清中透明质酸 （HA）、睾酮 （T）、雌二醇 （E2），比色法测定ALT、AST、A、G、肝组织羟脯氨酸 （HYP），计算脏器指数。结果 ①各用药组的ALT、AST，HA及肝组织HYP含量均降低，逆转A／G倒置，温肾组及合用组优于活血组，尤以合用组效果最好。②各组之间T及E2含量差异有统计学意义 （P＜0.05），各组T含量依次为：合用组＞温肾组＞正常组＞活血组＞模型组。各组E2含量依次为：模型组＞活血组＞正常组＞温肾组＞合用组。③温肾组及合用组的睾丸脏器指数升高，肾脏指数在各组之间差异无统计学意义。病理学显示，各用药组大鼠肝纤维化与模型组相比均有不同程度的改善，且以合用组最为显著。结论 活血温肾法具有较好的抗肝纤维化作用，可能是通过纠正性激素的紊乱而发挥作用的。从而为临床治疗肝纤维化提供了新思路、新方法和新药物。

温肾；活血；肝纤维化；大鼠

“肝肾相关”说源于 “肝肾同源”理论，肝肾因精髓血的互生而密切联系在一起，临床据此通过从肝论治肾病，从肾论治肝病的实践，而有了 “肝肾相关”说，用于指导临床，取效甚宏。胡剑北教授通过对 “肝肾相关”的文献、理论与临床研究认为其中的“肝”实体为人体肝脏［1］，“肾”实体包括人体生殖性腺和肾上腺［2］。现代研究也表明人体慢性肝病时存在明显的性激素环境紊乱及肾上腺功能低下［3］，肾上腺皮质激素具有良好的抗炎降解胶原纤维的作用，临床治疗慢性肝病有一定的效果，雌激素经实验研究证明对肝纤维化也有一定的作用［4］，肝肾实体之间存在着密切的关系。

针对肝纤维化治疗主要是以活血化瘀法为中心的多种不同治法的研究，以肝肾相关理论为指导，从肝肾形体角度进行治疗探讨的较少。归经理论是建立在中医脏腑经络理论基础上的，形体医理学认为中医理论与人体形体之间存在着密切的关系，那么归经也应和形体医理学的脏腑实体相对应，因此我们根据五版 《中药学》教材中记载的药物归经选择归肾经的温补肾阳药物，防治发生于肝脏实体的实验性肝纤维化的实验研究，以验证提出的上述假设。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SD雄性大鼠50只，体重180±20g，购于南京中医药大学实验动物中心 （合格证号：苏SYXK2003-0053）。从第4周开始，将四氯化碳致慢性肝损伤，大鼠随机分成正常组、模型组、温补肾阳组 （温肾组）、活血化瘀组 （活血组）、二方合用组 （合用组），

1.2 药物与试剂 温肾方：仙灵脾、仙茅、肉苁蓉、巴戟天、蛇床子、阳起石；活血方：鸡血藤、姜黄、五灵脂、赤芍、月季花、蟅虫。二方均采用常规煎煮方法，100目孔筛过滤，90℃水浴浓缩至1g／ml（含生药量），4℃冰箱冷藏备用。

主要试剂：血清肝功能试剂盒 （由上海荣盛生物技术有限公司）；羟脯氨酸 （HYP）测试盒 （南京建成生物工程研究所）；透明质酸 （HA）、睾酮 （T）、雌二醇（E2）ELISA试剂盒 （上海海军医学研究所）。

1.3 大鼠慢性肝纤维化模型的制作及给药方法 采用小剂量四氯化碳皮下注射法。于实验第一天起在大鼠背部皮下注射40%四氯化碳植物油溶液，0.3ML／100g，每三天一次，连续8周。从造模第4周起给药，正常组予以等容量蒸馏水灌胃；温肾组给予温肾方浓缩液（6.5g／ （kg·d））灌胃，活血组给活血方浓缩液5.6g／（kg·d）灌胃，合用组给二方合用浓缩液 （温肾方6.5+活血方5.6 g／（kg·d））灌胃。第8周末末次给药后戊巴比妥纳麻醉，腹主动脉取血离心，制备血清。肝、肾、睾丸等脏器称重，计算肝指数 （肝湿重／体重）、肾指数 （肾湿重／体重）、睾丸指数 （睾丸湿重／体重）。取右叶肝脏相同部位1克，与蒸馏水按1：9的比例置于玻璃匀浆器中充分碾磨混匀制备10%的肝组织匀浆液。

1.4 观察指标与方法 血清肝功能 （ALT、AST、白蛋白、球蛋白）、肝羟脯氨酸均用UV-2800型分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）检测；血清透明质酸、睾酮及雌二醇应用Anthos luey2安图酶标仪检测。

1.5 组织病理学观察 大鼠肝脏经10%福尔马林固定，石蜡包埋，HE染色，观察大鼠肝脏组织学变化。

1.6 统计学处理 计量资料采用表示，组间方差分析和q显著性检验，均采用SPSS 11.0统计软件处理。

2 结果

2.1 活血方、温肾方及合用方对肝纤维化大鼠血清肝功能的影响 模型组血清ALT、AST较正常组显著升高，白蛋白／球蛋白明显倒置；各治疗组与模型组比，以上几项指标均有显著改善 （P＜0.05），各组改善程度不一，以合用组疗效最佳，温肾组次之，活血组最差。与正常组比，差异有显著性 （P＜0.05）。（见表1）

表1 活血方、温肾方及合用方对慢性肝损伤大鼠血清肝功能的影响 （x±s）

2.2 活血方、温肾方及合用方对肝纤维化大鼠HA及肝HYP含量的影响 由表2可知，模型组较正常组以上二指标均明显升高，各治疗组显著降低，依次为活血组、温肾组、合用组。

表2 活血方、温肾方及合用方对慢性肝损伤大鼠HA及肝HYP含量的影响 （x±s）

2.3 活血方、温肾方及合用方对肝纤维化大鼠T及E2含量的影响 由表3可知，与正常组比较，模型组与活血组睾酮显著降低，雌二醇显著升主高，温肾组与合用组睾酮显著升高，雌二醇显著降低。

表3 活血、温肾及合用方对慢性肝损伤大鼠血清T及E2含量的影响 （x±s）

2.4 活血方、温肾方及合用方对肝纤维化大鼠脏器指数的影响 由表2可知，模型组肝指数明显高于正常组，治疗组肝指数显著小于模型组，活血组、温肾组、合用组肝指数依次减小 （P＜0.05）；肾指数在各组之间无显著差异，睾丸指数温肾组与合用组显著大于模型组。

表4 活血、温肾及合用方对慢性肝损伤大鼠肝、肾、睾丸指数的影响 （x±s，%）

2.5 温肾方、活血方及合用方对肝纤维化大鼠肝脏病理学改变的影响 正常组大鼠肝小叶结构完整，肝细胞排列整齐，无炎细胞浸润；模型组大鼠肝组织形成了假小叶，肝索排列紊乱，小叶内中央静脉偏离或消失，慢性炎细胞浸润。活血组大鼠肝组织有不完整的假小叶，肝索排列稍紊乱，汇管区纤维组织增生，少量炎症细胞浸润；温肾组肝组织内灶性炎细胞浸润，肝小叶间和中央静脉周围少量纤维组织增生。合用组大鼠肝小叶未被完全分割，肝索排列尚规则，汇管区偶有炎症细胞。

3 讨论

由于慢性肝病的多发性与危害性，防治慢性肝病成为目前研究的热点，采用的活血化瘀法、清热利湿法等确取得了一定的疗效。然而毋庸置疑，目前无论中医还是西医防治慢性肝病的方法均非理想，治疗效果有待提高，因而寻找一种更为有效的治疗方法，就显得异常迫切。

本课题以肝肾同源理论为指导，从肾论治肝病，以HA、HYP为检测指标，探讨温肾补阳药对肝纤维化的治疗作用。HA可以反映肝纤维化的发展变化，HYP（羟脯氨酸）是衡量机体胶原组织代谢的重要指标，测量HYP浓度可以较好的反映肝组织胶原的合成情况。实验结果表明温肾方药能改善肝功能，降低血清HA、肝组织HYP的浓度，病理结构改善，有良好的抗肝纤维化作用，且优于活血方。

一般认为雌激素具有抗肝纤维化作用［5］，且温肾方组成药物均有性激素样作用，本研究从性激素方面对其作用机理进行了初步探讨。本实验结果表明温肾组及合用组后血清雌二醇均出现了下降，睾酮水平上升，而模型组及活血组出现雌二醇升高，睾酮降低。温肾方中的仙灵脾、仙茅、肉苁蓉、巴戟天、蛇床子具有雌激素样作用［6-10］，而植物雌激素具有弱的雌激素样作用和抗雌激素作用，对于低激素水平者可以起到雌激素样作用，而对于高激素水平者可产生抗激素作用［11］。提示温肾方抗肝纤维化作用机制可能是通过调整紊乱的性激素而发挥抗纤维化作用。

本实验结果表明温肾方与活血方合用有着更显著的抗肝纤维化作用，可能是两方分别作用于不同的环节，活血化瘀药可以抑制肝星状细胞的增殖，抑制胶原纤维的增生［12-13］，温补肾阳药则通过调节体内性激素分泌，产生了协同作用，从而增加了疗效；或者两方合用，产生了新的化合物，以致疗效增强，具体机制还有待进一步探讨。总之这一结果提示温肾方与活血方联用可能为临床提供新的抗肝纤维化的思路、方法和药物。

［1］胡剑北.中医肝脏实体研究［J］．中国中医基础医学杂志，2004，1：16．

［2］胡剑北．中医肾脏实体研究［J］．中医药学刊，2004，22（3）：446-447，457．

［3］曾民德，萧树东．肝脏与内分泌［M］．北京：人民卫生出版社，1995：99-110．

［4］李东，李兵顺，刘金星，等．雌二醇抗肝纤维化的实验研究［J］．中华消化杂志，2002，22（10）：635．

［5］许君望，王云，龚均等．实验性肝纤维化形成的性别差异及雌激素的作用［J］．胃肠病学和肝病学杂志，2008，17（6）：496-499．

［6］王燕，颜虹，胡森科，张敬华．淫羊藿提取物的雌激素样作用研究［J］．西安交通大学学报，2009，30（3）：373-376．

［7］陶仕英，牛建昭，王继峰，等．二仙汤及其组方中药对幼年大鼠肾上腺雌激素受体表达的影响［J］．中国中医药信息杂志，2010，（5）．

［8］赵丕文，王大伟，牛建昭，等．红花等10种中药的植物雌激素活性研究［J］．中国中药杂志，2007，5：436-439．

［9］王寅，张巧艳．巴戟天雌激素样作用的实验研究［J］．时珍国医国药，2011，3：527-528．

［10］刘建新，张文平，连其深．蛇床子的植物雌激素样作用［J］．中国临床康复，2005，（23）：186-189．

［11］徐启根．植物雌激素与肝纤维化，中国水电医学［J］．2009，1：33-35．

［12］平键，成扬，徐列明，等．姜黄素激活PPARy下调肝星状细胞α-SMA和I型胶原的基因表达［J］．中国中西医结合消化杂志，2006，14（4）：215-218．

［13］江涛，郭顺根，蒙一纯．活血化瘀方对大鼠肝星形细胞活化的影响［J］．北京中医药大学学报，2001；24（3）：43-45．

Ef f e c t an d Me c h anism o f Kid ne y-War min g De c o c tion on Fib r o sis o f t he Liv e r in Ra t

W ang Xiu Yan Yanxin
（Centre of Combination of TCM and West M edicineWannan M edical college'W uhu'241002'China）

Object To investigate the effect and mechanism of Kidney-Warming Decoction on CCL4-induced fibrosis of the liver in rats．Methods Using CCL4-induced fibrosis of the liver in rats，randomly divided into the normal group，the model group，kidney-warming group，promoting blood flow group and combination group．The latter three groups were intragastric administration with Kidney-Warming Decoction，Promoting Blood Flow Decoction and Combination Decoction．After 4 weeks，detected hyaluronic acid（HA），T，E2by ELISA，determined the ALT，AST，A，G，hydroxyproline（HYP）of liver tissue by colorimetric method，and calculated visceral index．Results ①The ALT，AST，HA and HYP concentration of three treatment groups were decreased，reversal of white／ball upside down．The effect of kidney-warming group and combination group were better than promoting blood flow group，the combination group was the best．②Testosterone（T）and estradiol（E2）concentration of each group had significant difference（P＜0.05）．T concentration in order：kidney-warming group＞combination group＞normal group＞promoting blood group＞model group；E2concentration in order：model group＞promoting blood group＞normal group＞combination group＞kidney-warming group．③Testis index of kidney-warming group and combination group were increased and renal index was no significantly different between groups．Pathology showed that the degree of liver fibrosis in medication group rats was lower than mode group，and combination group was the most significant．Conclusion It is suggested that Kidney-Warming Decoction had good effect on treating hepatic fibrosis，may be through adjusting sex hormones disorder．It provides new ideas，new methods and new drugs for the clinical treatment of hepatic fibrosis．

Kidney-Warming Decoction；hepatic fibrosis；hydroxyproline；sex hormone；Rats

doo：10.3969／j.issn.1672-2779.2014.08.099

1672-2779（2014）-08-0001-02

杨 杰 本文校对：

2013-01-02）