糖尿病小鼠皮肤组织中晚期糖基化终末产物的表达及其对胶原纤维的影响

杨圣菊 孟国梁 顾黎雄 王建力

糖尿病小鼠皮肤组织中晚期糖基化终末产物的表达及其对胶原纤维的影响

杨圣菊 孟国梁 顾黎雄 王建力

目的观察不同病程糖尿病小鼠皮肤组织晚期糖基化终末产物（AGE）的表达及其对胶原纤维的影响。方法健康8周龄C57BL/6J雄性小鼠采用小剂量链佐星（50 mg/kg）多次注射法建立糖尿病模型，分别在造模后第4周和12周处死小鼠，取背部中央皮肤，HE染色观察组织学结构，样本碱水解法测定羟脯氨酸水平反映胶原总量，限制性胃蛋白酶降解法测定胶原交联程度，实时定量PCR法测定Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原基因表达，荧光分光光度法和Western印迹检测晚期糖基化终末产物水平，硫代巴比妥酸法测定丙二醛含量。统计学分析采用t检验。结果镜下可见糖尿病小鼠皮肤组织明显变薄，胶原呈进行性减少。第4周和12周时，糖尿病组小鼠皮肤组织羟脯氨酸含量与正常对照组比较显著降低[（684.5±76.7）比（787.7±87.7）mg/g，（558.1±73.1）比（757.8±75.3）mg/g，均P＜0.01]，皮肤AGE水平显著上升[（37.47±10.65）比（26.39±3.74）AUF/mg羟脯氨酸，（47.70±5.66）比（29.91±6.50）AUF/mg羟脯氨酸，均P＜0.01]，丙二醛含量显著增加[（6.62±0.47）比（4.82± 0.56） μmol/L，（8.63± 0.36）比（5.15± 0.46） μmol/L，均P＜ 0.01]，交联胶原以及Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达均下降（P＜0.01或0.05），糖尿病12周组非交联胶原亦明显下降（P＜0.05）；与糖尿病4周组相比，糖尿病12周组小鼠皮肤羟脯氨酸含量、Ⅰ型胶原表达进一步减少（P＜0.05），AGE和丙二醛水平进一步增加（P＜0.01）。结论糖尿病小鼠皮肤组织胶原纤维性状发生改变，可能与皮肤组织中晚期糖基化终末产物水平上升及氧化损伤加剧有关。

皮肤；糖尿病；胶原Ⅰ型；胶原Ⅲ型；糖基化终产物，高级

皮肤病变是糖尿病患者常见并发症之一，国内外报道约30%的糖尿病患者合并皮肤损害,如果同时考虑代谢和微循环障碍，几乎所有糖尿病患者均有皮肤受累。该病变早期最显著的变化为真皮内胶原纤维减少［1］，而皮肤胶原纤维性状的另外两个重要特征胶原交联程度和胶原纤维类型是否发生明显改变尚不清楚。我们的前期研究发现，晚期糖基化终末产物（advanced glycosylation end products，AGE）表达增加与人瘢痕疙瘩组织中纤维增生关系密切［2］。AGE可使胶原蛋白可溶性下降，进而造成皮肤胶原纤维性状发生改变。本研究拟通过分析不同病程糖尿病小鼠皮肤组织中AGE的表达，初步探讨其对皮肤组织胶原纤维的影响与意义。

材料与方法

一、实验动物

正常健康8周龄C57BL/6J雄性小鼠60只，体重20～30 g，由南通大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（苏）2008-0010。

二、主要试剂与仪器

链佐星（streptozotocin，美国Sigma-Aldrich公司），胃蛋白酶（美国BBI公司），羟脯氨酸测试盒（南京建成生物工程研究所），总RNA提取试剂盒（RNAiso Plus）、逆转录试剂盒、SYBR® Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）、Bulk（日本 TaKaRa 公司），丙二醛测试盒、放射免疫沉淀法（RIPA）组织裂解液（海门碧云天生物技术有限公司），兔抗小鼠AGE抗体（英国Abcam公司），兔抗小鼠磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH，上海康成生物工程有限公司），辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体（武汉博士德生物科技有限公司）。血糖测量仪及测量试纸（美国Johnson&Johnson公司），实时定量PCR仪（美国ABI公司），荧光分光光度计（日本Shimadzu公司），增强化学发光（ECL）仪（美国Bio-Rad公司）。

三、实验方法

1.动物处理与分组：将60只小鼠随机分为正常对照组和糖尿病组，禁食（不禁水）14～16 h后，糖尿病组（40只）腹腔注射链佐星50 mg/kg（临用前以0.1 mol/L枸橼酸缓冲液溶解），对照组（20只）腹腔注射等量0.1 mol/L枸橼酸缓冲液，连续5 d，间隔1周后取尾静脉血测空腹血糖，＞11.1 mmol/L为糖尿病造模成功，并定期监测血糖水平［3］。取糖尿病成模小鼠20只随机分为两组，每组10只，然后分别在链佐星末次注射4周（糖尿病4周组）和12周（糖尿病12周组）后，用硫化钡脱毛剂（硫化钡∶滑石粉∶洗衣粉 =2∶2∶1）脱去背部鼠毛后处死小鼠，取鼠背部中央约2 cm×2 cm的全层皮肤标本，用4%中性甲醛固定，常规苏木精-伊红（HE）染色，观察皮肤组织学改变；背部余下皮肤液氮冻存后置-80℃冰箱备用。对照组在相应的时间点各取10只小鼠进行相同检测。

2.羟脯氨酸含量检测：按试剂盒说明进行,采用样本碱水解法测定皮肤组织中羟脯氨酸含量。

3.胶原交联程度检测：采用限制性胃蛋白酶降解法分别测量皮肤组织中非交联胶原（non-crosslinked collagen）及交联胶原（cross-linked collagen），计算交联与非交联胶原的含量，并以两者比值反映胶原交联程度［4］。

4.实时定量PCR检测皮肤组织中Ⅰ型和Ⅲ型胶原的表达：取约100 mg皮肤组织，加入1 ml RNAiso Plus充分匀浆后，提取总RNA。取500 ng RNA用逆转录试剂盒合成cDNA，然后以cDNA为模板，对皮肤组织中Ⅰ型和Ⅲ型胶原的基因表达进行实时定量PCR检测，反应体系为：SYBR®预混液10 μl，上下游引物（5 nmol/L）各 1 μl，双蒸水 6 μl，cDNA样品2 μl，反应结束后读取阈值循环数Ct值，以GAPDH为内参，用△△Ct法分析目的基因mRNA表达量。引物信息如下：Ⅰ型胶原，上游5′-ATCTCCTGGTGCTGATGGAC-3′，下游 5′-ACCTTG TTTGCCAGGTTCAC-3′；Ⅲ型胶原，上游 5′-AAACT GGTGAACGTGGCTATG-3′，下游 5′-TTTTCACCTC CAACTCCAACAATG-3′；GAPDH，上游 5′-GGTGAA GGTCGGTGTGAACG-3′，下游 5′-CTCGCTCCTGGA AGATGGTG-3′。

5.AGE测定：皮肤组织按100 mg∶1 ml比例加入磷酸盐缓冲液（PBS）匀浆后，应用荧光分光光度计测定组织匀浆中AGE荧光强度，激发光波长为370 nm，发射光波长为440 nm，狭缝间隙3 nm，直接测定荧光强度。AGE含量用皮肤羟脯酸含量校正后表示为每毫克羟脯氨酸所含荧光强度（AUF）［4］。另取皮肤组织按100 mg∶1 ml比例加入RIPA组织裂解液（含蛋白酶抑制剂），匀浆提取蛋白，2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠（BCA）法测定蛋白浓度。然后取各样本蛋白质50 μg进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离（浓缩胶5%，分离胶10%），转移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜后，室温下5%脱脂奶粉封闭 2 h，分别加入 AGE（1∶1 000）及GAPDH抗体（1∶6 000）4℃孵育过夜，充分洗涤后，在膜的正面滴加含有相应二抗的封闭液，室温摇床反应2 h，ECL法显影。

6.丙二醛测定：按试剂盒说明，采用硫代巴比妥酸法测定皮肤组织中丙二醛含量。

结 果

一、血糖检测

链佐星注射造模后，小鼠出现一定程度的体重下降、饮水增多、多尿等症状。血糖检测发现，链佐星造模组小鼠在实验期间血糖水平均高于11.1 mmol/L，其中注射链佐星4周和12周后糖尿病组小鼠空腹血糖分别为（18.3±2.9）mmol/L和（15.7±3.0）mmol/L，与同周龄对照组相比明显升高[（4.4±0.6）mmol/L和（4.5±0.5）mmol/L，均P＜0.01]，提示糖尿病小鼠造模成功。

二、组织学检测

对照组皮肤角质形成细胞层次清晰,真皮内胶原排列规则；糖尿病组表皮变薄，角质形成细胞减少，局部为单层排列,真皮层厚度较对照组减少，排列相对致密，皮下脂肪萎缩，且随病程延长进一步加重（图 1）。

三、皮肤组织胶原纤维性状分析

见表1。糖尿病组建模4周及12周后，小鼠皮肤组织总羟脯氨酸含量与同周龄对照组相比均出现明显下降（P值分别 ＜0.05，0.01），且糖尿病12周组较4周组亦有一定程度的降低（t=3.77，P＜0.01）。与同周龄对照组相比，糖尿病4周组和12周组小鼠皮肤组织中交联胶原下降明显（均P＜0.01），且糖尿病12周组与4周组相比亦显著降低（t=2.92，P＜0.05）。值得注意的是，与同周龄对照组相比，糖尿病组小鼠4周组和12周组皮肤交联胶原与非交联胶原比值均明显下降（P＜0.05）。

糖尿病4周及12周组小鼠皮肤组织中Ⅰ型胶原mRNA相对表达水平分别为（0.36±0.11）和（0.13±0.06），与同周龄对照组（分别为0.97±0.37和1.02±0.52）相比明显下降（t值分别为3.83和4.22，均P＜0.01）；Ⅲ型胶原mRNA相对表达水平分别为（0.19±0.09）和（0.10±0.05），较同周龄对照组（分别为1.10±0.50和0.66±0.21）亦明显下降（t分别为4.40和6.36，均P＜0.01）；与糖尿病组4周时相比，12周组Ⅰ型胶原表达进一步下降（t=4.35，P＜ 0.01）。

图1 小鼠背部中央皮肤组织HE染色（标尺：100 μm）1a：对照组注射枸橼酸缓冲液4周后，皮肤角质形成细胞和真皮内胶原层次清晰，排列规则，皮下脂肪层正常；1b：糖尿病组建模4周后：表皮和真皮层变薄，皮下脂肪萎缩；1c：对照组注射枸橼酸缓冲液12周后，皮肤角质形成细胞和真皮内胶原稍有减少，但层次清晰，排列规则，皮下脂肪层无明显异常；1d：糖尿病组建模12周后，表皮和真皮层明显变薄，皮下脂肪大量萎缩

表1 不同病程糖尿病小鼠皮肤组织中总羟脯氨酸、交联胶原和非交联胶原中羟脯氨酸含量（±s）

表1 不同病程糖尿病小鼠皮肤组织中总羟脯氨酸、交联胶原和非交联胶原中羟脯氨酸含量（±s）

注：t值为同周龄对照组与糖尿病组相比

4周组别 只数交联胶原/非交联胶原对照组 10 787.7±87.7 472.2±67.4 315.5±45.4 1.5±0.3 757.8±75.3 433.6±76.3 324.2±36.1 1.2±0.2糖尿病组 10 684.5±76.7 375.8±65.8 308.7±26.3 1.4±0.3 558.1±73.1 282.8±76.3 275.3±41.1 1.0±0.3 t值 2.80 3.24 0.41 2.55 6.02 4.42 2.83 2.74 P值 ＜0.05 ＜0.01 ＞0.05 ＜0.05 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.05 ＜0.05 12周总羟脯氨酸（mg/g）交联胶原中羟脯氨酸（mg/g）非交联胶原中羟脯氨酸（mg/g）交联胶原/非交联胶原总羟脯氨酸（mg/g）交联胶原中羟脯氨酸（mg/g）非交联胶原中羟脯氨酸（mg/g）

四、皮肤组织中AGE水平

荧光分光光度法检测发现（表2），与同周龄对照组相比，糖尿病小鼠皮肤组织中AGE含量明显增加（P＜0.01），糖尿病12周组较4周组上升（t=2.68，P＜0.05）。蛋白印迹检测亦有类似发现（图2，表2），糖尿病4周和12周组皮肤组织中AGE蛋白表达水平均较同周龄对照组明显增加（均P＜0.01），糖尿病12周组较4周组进一步增加（t=4.60，P＜ 0.01）。

五、皮肤组织中丙二醛水平

糖尿病组4周及12周时皮肤组织中丙二醛水平均明显高于同周龄对照组（均P＜0.01），糖尿病组12周组较4周组明显增加（t=10.69，P＜0.01）。见表2。

讨 论

胶原中羟脯氨酸的含量较稳定，约占胶原蛋白总量的13.4%，故测定皮肤组织羟脯氨酸的含量便可计算出胶原的含量［5］。本研究结果表明，不同周龄的糖尿病小鼠皮肤组织羟脯氨酸含量出现明显下降，并伴有不同程度的皮肤全层变薄、皮下脂肪进行性萎缩、真皮层胶原纤维减少且排列致密，这可能是糖尿病机体皮肤变薄及弹性变差的病理学基础。

图2 Western印迹检测小鼠皮肤组织中晚期糖基化终末产物（AGE）水平 1、3：分别为对照组注射枸橼酸缓冲液4周和12周后；2、4：分别为糖尿病组建模4周和12周后

皮肤胶原纤维性状尚包括皮肤胶原交联程度。交联后的胶原分子理化性质和生物学性能均发生变化，变得僵硬，不容易溶解和被蛋白酶降解，从而使含有胶原的基质蓄积，成为皮肤纤维增生性疾病的重要诱发因素之一；另一方面，胶原交联有利于胶原纤维聚积，进而促进创面的修复与愈合［6］。在糖尿病小鼠皮肤组织中，我们发现胶原纤维交联程度明显下降，提示皮肤存在着胶原交联的障碍，不利于糖尿病皮肤组织的创面修复，糖尿病病程越长，这一现象越严重。另外，皮肤组织主要由Ⅰ型和Ⅲ型胶原组成，其中Ⅰ型胶原弹性小、张力较大，Ⅲ型胶原弹性较好，两者和其他间质一起形成复杂的三维网络结构，在维持皮肤正常结构和功能完整性等方面起着非常重要的作用［7-8］。我们发现，在糖尿病小鼠皮肤组织中Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的表达均明显下降，这可能与胶原纤维总量水平相对较低有关，但Ⅰ型胶原和Ⅲ胶原纤维的比例并未产生明显变化。

目前认为，AGE对皮肤胶原纤维具有双向作用［2,9-10］。一方面，AGE可通过结缔组织生长因子、Smad蛋白等介导皮肤成纤维细胞增生、细胞外基质沉着，甚至造成皮肤胶原纤维增生性疾病（如瘢痕疙瘩、系统性硬化病等）的发生［9］；另一方面，AGE 可通过激活烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4，增加内质网应激，进一步引起caspase-3活化，从而造成皮肤成纤维细胞凋亡，阻碍皮肤创伤愈合［10］。我们的研究发现，糖尿病小鼠皮肤组织中AGE水平明显高于对照组，丙二醛水平明显升高，这可能是由于皮肤真皮层和微血管壁细胞间基质含有大量的胶原纤维，赖氨酸和羟基赖氨酸含量丰富，是糖基化的好发部位［11］；在糖尿病慢性高血糖作用下，胶原蛋白极易发生糖基化修饰，从而造成皮肤组织中AGE产生增多并形成恶性循环［12］；AGE再作用于其受体，引起活性氧簇产生增加，升高自由基，造成氧化损伤［13］，引起胶原纤维变性和坏死。同时，胶原纤维作为皮肤组织主要的细胞成分，高血糖及AGE等毒性物质持续作用，可直接改变胶原纤维空间结构，抑制成纤维细胞分化，下调皮肤组织抗氧化能力，增加氧化应激，并可通过影响细胞赖以生存的微环境造成修复细胞迁移、增殖能力下降，细胞外基质合成障碍，选择性地诱导成纤维细胞内质网应激及凋亡，破坏胶原纤维，造成迁移到创面的成纤维细胞数目减少，最终表现为皮肤变薄、胶原纤维表达减少及创面愈合延缓［14］。AGE的聚集亦可使Ⅳ型胶原、层黏连蛋白、硫酸软骨素等细胞外基质分子发生糖基化修饰，造成形态及功能异常，进而影响皮肤电荷和空间屏障的完整性，加速糖尿病皮肤病变的发生发展［15］。

表2 不同病程糖尿病小鼠皮肤组织中晚期糖基化终末产物（AGE）和丙二醛含量（±s）

表2 不同病程糖尿病小鼠皮肤组织中晚期糖基化终末产物（AGE）和丙二醛含量（±s）

注：t值为同周龄对照组与糖尿病组相比

4周组别 只数丙二醛（μmol/L）对照组 10 26.39±3.74 1.00±0.10 4.82±0.56 29.91±6.50 1.18±0.18 5.15±0.46糖尿病组 10 37.47±10.65 1.89±0.33 6.62±0.47 47.70±5.66 3.01±0.36 8.63±0.36 t值 3.10 5.10 7.80 6.53 9.16 18.75 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 12周AGE（AUF/mg羟脯氨酸）AGE相对表达（n=4）丙二醛（μmol/L）AGE（AUF/mg羟脯氨酸）AGE相对表达（n=4）

总之，本研究发现，糖尿病小鼠皮肤组织胶原纤维性状发生明显改变，具体表现为胶原纤维总量减少，交联程度降低，Ⅰ型和Ⅲ型胶原表达下调，可能与皮肤组织中高AGE水平引起氧化损伤有关，提示抑制AGE的合成、阻断AGE的作用环节或清除皮肤微环境中的AGE，有可能成为调控糖尿病皮肤胶原纤维性状的新途径和新手段。

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2014-01-17）

（本文编辑：尚淑贤）

Expressions of advanced glycosylation end products in skin of diabetic mice and their influence on collagen fibers

Yang Shengju*,Meng Guoliang,Gu Lixiong,Wang Jianli.*Department of Dermatology and Venereology,Affiliated Hospital of Nantong University,Nantong 226001,Jiangsu,China

；Wang Jianli,Email；pfkwang@163.com

ObjectiveTo investigate the expressions of advanced glycosylation end products（AGE）in skin of mice with diabetes mellitus（DM）for different durations,and to evaluate their influence on collagen fibers.MethodsForty healthy 8-week-old male C57BL/6J mice were divided into DM group （n=20）and control group（n=20）to receive multiple intraperitoneal injections of low dose streptozotocin （50 mg/kg）and citric acid buffer（0.1 mol/L）,respectively,for 5 consecutive days.Ten mice were sacrificed in each group on week 4 and 12 respectively after the last intraperitoneal injection,and full-thickness skin tissue samples were harvested from the middorsal region of each mouse.Then,hematoxylin-eosin （HE） staining was performed to observe histological changes,and total collagen content was estimated according to hydroxyproline content measured by an alkalinehydrolysis method.The cross-linking degree of collagen was determined by Edman degradation method using pepsin,the mRNA expression level of collagen type I andⅢby real-time quantitative PCR,the content of AGE by fluorospectrophotometry and Western blotting,and the level of malondialdehyde（MDA）by using a thiobarbituric acid method.Statistical analysis was carried out byttest.ResultsAs light microscopy showed,the skin became obviously thinner in the diabetic mice with a progressive decrease in the number of collagen fibers in comparison with the control mice.On week 4 and 12 after the last injection,the diabetic mice exhibited a significant reduction in the content of hydroxyproline（（684.5 ± 76.7） vs.（787.7 ± 87.7） mg/g,（558.1 ± 73.1） vs.（757.8 ± 75.3） mg/g,bothP＜0.01）and in the levels of cross-linked collagen as well as mRNA expressions of collagen I and III（P＜0.01 or 0.05）,but a significant increase in the content of AGE （（37.47 ± 10.65） vs.（26.39 ± 3.74） AUF/mg hydroxyproline,（47.70±5.66）vs.（29.91±6.50）AUF/mg hydroxyproline,bothP＜0.01）and MDA （（6.62±0.47） vs.（4.82 ± 0.56） μmol/L,（8.63 ± 0.36） vs.（5.15 ± 0.46） μmol/L,bothP＜ 0.01） in skin tissue,compared with the control mice.The level of non-cross-linked collagen in skin tissue was also lower in the diabetic mice than in the control mice on week 12 （P＜0.05）.Moreover,the contents of hydroxyproline and the expression levels of collagen I in skin were significantly lower（P＜ 0.05）,but the levels of AGE and MDA were significantly higher（P ＜0.01）in the diabetic mice on week 12 than in those on week 4.ConclusionsThe characteristics of collagen fibers in skin are altered in diabetic mice when compared with normal control mice,which may be associated with increased AGE content and oxidative injury in skin.

Skin；Diabetes mellitus；Collagen typeⅠ；Collagen typeⅢ；Glycosylation end products,advanced

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.011.005

江苏省高校自然科学基金（12KJB310012）；南通大学自然科学项目（11Z015）

226001江苏，南通大学附属医院皮肤性病科（杨圣菊、顾黎雄、王建力）；南通大学药学院药理学系（孟国梁）

王建力，Email：pfkwang@163.com