siRNA 干扰水通道蛋白3和磷脂酶D2表达对A431细胞株生长和凋亡的影响

2014-12-04王小勇陶承军袁丞达王敏磊应航宇任金平

中华皮肤科杂志 2014年11期

王小勇陶承军袁丞达王敏磊应航宇任金平

王小勇陶承军袁丞达王敏磊应航宇任金平

目的探讨水通道蛋白3（AQP3）和磷脂酶D2（PLD2）在人皮肤鳞状细胞癌细胞株A431细胞增殖和凋亡中的作用。方法针对AQP3和PLD2各设计3条siRNA，用脂质体转染法将siRNA导入A431细胞。用荧光定量PCR方法筛选出其中干扰效果最佳的AQP3-siRNA和PLD2-siRNA，Western印迹法检测转染后AQP3和PLD2蛋白的表达水平。将A431细胞分为5组：正常培养组（不加任何处理），转染试剂组（加入转染试剂），阴性对照组（转染阴性对照siRNA），AQP3-siRNA组（转染AQP3-siRNA），PLD2-siRNA组（转染PLD2-siRNA）。CCK8法检测AQP3和PLD2表达下调对A431细胞增殖的影响，膜联蛋白-V-异硫氰酸荧光素/碘化丙锭双染色后用流式细胞仪检测细胞凋亡。结果用脂质体转染法将siRNA导入A431细胞后，AQP3和PLD2的mRNA和蛋白表达均较阴性对照组明显下降。与阴性对照组比较，转染AQP3-siRNA后A431细胞增殖在 24、48、72 h均受到明显抑制（t值分别为 24.10、11.00、9.54，均P＜ 0.01）；转染 PLD2-siRNA 后，A431细胞增殖同样在24、48、72 h均受到明显抑制（t值分别为30.47、7.02、8.73，均P＜0.01）。与阴性对照组比较，转染AQP3-siRNA后，A431细胞凋亡在48 h和72 h均明显增加（t值分别为11.36、20.91，均P＜0.01）；转染PLD2-siRNA后，A431细胞凋亡在72 h明显增加（t值为4.86，P＜0.05）。结论siRNA下调AQP3或PLD2表达可抑制A431细胞增殖，诱导A431细胞凋亡。

水通道蛋白质3；磷脂酶D；RNA，小分子干扰；癌，鳞状细胞；细胞系，肿瘤

水通道蛋白（aquaporin，AQP）是一类介导水分子跨膜运动的转运蛋白的总称，其中AQP3是皮肤中含量最丰富和主要的AQP［1］。研究表明，AQP3能促进人角质形成细胞增殖和促进皮肤肿瘤发生［2］。磷脂酶D（phospholipase D，PLD）是一类脂肪分解酶，许多研究表明,PLD在一些肿瘤的发生、分化、凋亡及转移等过程中起着极其重要的作用［3］。AQP3和PLD2在功能上密切相关，具有协同作用。有研究显示，AQP3和PLD2在皮肤肿瘤中异常表达，并且与细胞增殖有关［4］。本研究通过RNA干扰技术，阻断AQP3和PLD2的表达，观察转染后人皮肤鳞状细胞癌细胞株A431细胞增殖和凋亡的变化。

材料与方法

一、主要试剂和仪器

人皮肤鳞状细胞癌细胞株A431来自中国典型培养物保藏中心。AQP3-siRNA和PLD2-siRNA产自上海吉玛制药技术有限公司，LipofectamineTM2000试剂盒产自美国Gibco公司。CCK8试剂盒产自日本同仁化学社。膜联蛋白-V-异硫氰酸荧光素/碘化丙锭（annexin-V-FITC/PI）细胞凋亡试剂盒产自美国Invitrogen公司。IQ SYBR Green Supermix定量PCR试剂产自美国Bio-Rad公司。AQP3抗体和磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）抗体产自美国Bioworld公司，PLD2抗体产自美国Abgent公司。FACSVerse流式细胞仪产自美国BD公司。CFX connect适时PCR仪和ChemiDoc XRS+凝胶成像仪产自美国Bio-Rad公司。

二、方法

1.细胞转染：siRNA脂质体转染按产品说明书进行。转染前24 h将5×105个细胞接种到6孔板中，加入无抗完全培养基，细胞融合度为80%～90%时准备转染。稀释siRNA和LipofectamineTM2000，混匀，室温下静置20 min。将混匀的siRNA和LipofectamineTM2000加入到细胞培养板中，4～6 h后换液继续培养。siRNA先用不含RNA酶的蒸馏水配成 20 μmol/L，转染时最终浓度为 0.05 μmol/L。

2.siRNA的筛选和验证：针对AQP3和PLD2各设计3条siRNA，细胞转染，用荧光定量PCR方法筛选出其中最佳的AQP3-siRNA和PLD2-siRNA。分别用AQP3-siRNA和PLD2-siRNA进行细胞转染，用Western印迹法检测siRNA转染后AQP3和PLD2蛋白的表达水平，进一步验证干扰效果。将A431细胞分为5组：正常培养组（不加任何处理），转染试剂组（加入转染试剂），阴性对照组（转染阴性对照siRNA），AQP3-siRNA组（转染AQP3-siRNA），PLD2-siRNA组（转染PLD2-siRNA）。

3.荧光定量PCR：按相关产品说明书进行。转染24 h后用Trizol-离心柱法提取转染细胞总RNA，检测纯度和浓度。取1 μg总RNA行逆转录，反应体积20 μl，-70℃保存cDNA。荧光定量PCR反应体积为 25 μl，50 ℃预变性 3 min，95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s、59 °C 20 s、72 ℃ 20 s，40 个循环。AQP3上游引物序列为 5′-CCCCTCTGGACACTTGGAT-3′，下游为 5′-CACGAAGACACCCGCAAT-3′。PLD2 上游引物序列为 5′-GCCTTGGGCATCAACAGT-3′，下游引物序列为 5′-AGGTCAGTCAGTCGGTAGTG-3′。内参照GAPDH的上游引物序列为5′-AGAAGGCT GGGGCTCATTTG-3′，下游引物序列为 5′-AGGGGC CATCCACAGTCTTC-3′。用 2-ΔΔCt方法来分析和计算结果。

4.Western印迹分析：转染24 h后按常规方法提取细胞总蛋白，-70°C保存。二喹啉甲酸（BCA）法测定蛋白浓度。蛋白上样量为每泳道25 μg。进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜（PVDF膜），封闭。孵育一抗，室温2 h。孵育二抗，室温1 h。ECL化学发光显影。实验重复3次。导出照片后在Image J软件下读取各条带吸光度值（A）。

5.CCK8法检测细胞增殖：按试剂盒说明书进行。转染细胞在96孔板中培养24、48和72 h后，每孔加入10 μl CCK8溶液，细胞培养箱内孵育1 h。450 nm波长下，在酶标仪上测定各孔A值。实验设6个复孔。细胞增殖率=（各实验组A值/正常培养组A值）×100%。

6.Annexin-V-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡：按试剂盒说明书进行。转染细胞培养24、48和72 h后，加入Annexin V-FITC，于2～8℃避光条件下孵育15 min。加入10 μl PI后，于2～8℃避光条件下孵育5 min。流式细胞仪检测细胞凋亡。实验设3个复孔。

三、统计学分析

结果

一、siRNA的筛选和验证

荧光定量PCR显示，针对基因AQP3所设计的3条siRNA中，AQP3-siRNA-2对AQP3的干扰效果最佳，但该序列对PLD2基因也有抑制作用，故最终选择AQP3-siRNA-1进行后续实验。针对基因PLD2所设计的3条siRNA中，PLD2-siRNA-1具有对PLD2的最佳干扰效果，故选择PLD2-siRNA-1序列进行后续实验。

Western印迹显示，与阴性对照组比较，转染AQP3-siRNA-1后，AQP3蛋白表达明显下降（t=60.88，P＜ 0.01）；转染 PLD2-siRNA-1后，PLD2蛋白表达明显下降（t=12.42，P＜ 0.01）。见图 1、表 1。

二、AQP3和PLD2表达下调对A431细胞增殖的影响

转染AQP3-siRNA后，A431细胞增殖在24、48、72 h均受到明显抑制（与阴性对照组比较，t值分别为24.10、11.00、9.54，均P＜ 0.01）。转染 PLD2-siRNA后，A431细胞增殖同样在24、48、72 h均受到明显抑制（与阴性对照组比较，t值分别为30.47、7.02、8.73，均P＜0.01）。转染试剂组和阴性对照组与正常培养组比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。见表 2。

三、AQP3和PLD2表达下调对A431细胞凋亡的影响

图1 siRNA转染对A431细胞水通道蛋白3（AQP3）和磷脂酶D2（PLD2）蛋白表达的影响 1：正常培养组；2：转染试剂组；3：阴性对照组；4：PLD2-siRNA组；5：AQP3-siRNA组

表1 siRNA转染对A431细胞水通道蛋白3（AQP3）和磷脂酶D2（PLD2）蛋白表达的影响（±s）

注：n=3。a：与阴性对照组比较，P＜0.01

细胞分组 AQP3/GAPDH灰度比值 PLD2/GAPDH灰度比值正常培养组 0.57±0.06 0.80±0.09转染试剂组 0.59±0.06 0.80±0.09阴性对照组 0.52±0.05 0.81±0.09 PLD2-siRNA组 0.55±0.05 0.59±0.06a AQP3-siRNA组 0.28±0.04a 0.93±0.10

转染AQP3-siRNA或PLD2-siRNA在24 h时各组间差异均无统计学意义。转染AQP3-siRNA后，A431细胞凋亡在48 h和72 h均明显增加：与阴性对照组比较，48 h时t值为11.36，P＜0.01；72 h时t值为20.91，P＜0.01。转染PLD2-siRNA后，A431细胞凋亡在72 h明显增加（与阴性对照组比较，t值为4.86，P＜0.05）。转染试剂组和阴性对照组与正常培养组比较，差异均无统计学意义（均P＞ 0.05）。见表2。

讨论

研究表明，AQP3在皮肤鳞状细胞癌中高表达，并且与肿瘤的分化有显著相关性［5］。亦有研究表明，AQP3在皮肤鳞状细胞癌中呈“补丁样”表现，即在肿瘤的某些区域高表达，在某些区域很少或没有表达，而且这些表达下调的区域是肿瘤增生最活跃的区域，表明AQP3的下调能促进皮肤肿瘤的发生［4］。本实验进一步证实，AQP3表达与皮肤鳞状细胞癌细胞的增殖和凋亡相关。

PLD及其水解产物均是重要的脂质第二信使，在肿瘤的发病机制中可能起多重作用，但关于PLD与皮肤肿瘤关系的研究报道不多。研究发现，过度表达PLD2的成纤维细胞的形态学和生长特性均发生改变，即处于细胞周期S期的细胞比例增加，细胞周期蛋白D3的表达异常上调，表现出恶性转化的特点［6］。既往研究表明，在A431细胞中有PLD1和PLD2的表达［7］，我们最近研究发现，浸润性鳞状细胞癌PLD2表达水平显著高于正常表皮［8］。这些结果均表明PLD2的表达增加可能与皮肤恶性肿瘤的发病有关。而本实验中用siRNA抑制PLD2的表达后，人皮肤鳞状细胞癌细胞株A431细胞增殖受到抑制，细胞凋亡增加，也进一步证实PLD2对皮肤鳞状细胞癌发生的促进作用。

在肿瘤治疗中，诱导肿瘤细胞凋亡是一种重要的治疗手段。本研究用siRNA干扰AQP3和PLD2的表达可诱导A431细胞凋亡，表明其在鳞状细胞癌的治疗中可能发挥作用。已有研究表明，PLD具有抗肿瘤细胞凋亡的作用，可能的机制有：通过激活哺乳动物西罗莫司靶蛋白（mTOR）信号通路产生抗凋亡效应［9］；降低野生型P53蛋白的稳定性进而抑制DNA损伤诱导的凋亡［10］。抑制AQP3的表达亦能抑制皮肤肿瘤的发生，可能的机制有：减少甘油代谢和三磷酸腺苷产生［4］；减少局部黏着激酶（FAK）磷酸化，进而减少下游细胞外调解蛋白激酶（Erk）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）的磷酸化［11］；通过下调P53和上调Bcl-2和X连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）抑制亚砷酸盐诱导的肿瘤细胞凋亡［12］。

表2 水通道蛋白3（AQP3）和磷脂酶D2（PLD2）表达下调对A431细胞增殖和凋亡的影响（%，±s）

注：统计学比较分析时，细胞增殖n=6，细胞凋亡n=3。与阴性对照组比较，a：P＜0.01，b：P＜0.05

细胞分组 24 h 48 h 72 h增殖率凋亡率增殖率凋亡率增殖率凋亡率正常培养组 100.00±4.01 3.57±0.25 100.00±1.04 6.00±1.19 100.00±1.60 16.77±2.48转染试剂组 98.95±3.25 3.79±0.93 96.94±3.55 6.97±0.62 96.25±6.24 18.73±3.91阴性对照组 98.51±3.29 4.15±0.89 93.41±5.64 6.13±0.19 96.21±3.88 17.60±1.65 AQP3-siRNA组 69.58±3.33a 4.43±0.32 59.09±3.03a 10.50±0.42a 75.72±4.35a 27.43±1.30a PLD2-siRNA组 64.07±4.37a 3.22±0.95 62.17±6.09a 5.20±1.56 76.54±4.11a 27.03±3.56b

AQP3和PLD2在结构及功能上密切相关。AQP3和PLD2同时分布在角质形成细胞膜上的富含小窝蛋白（caveolin）的区域［13］。AQP3 和 PLD2 作为一个整体，AQP3/PLD2信号分子相互作用，共同调节着角质形成细胞的分化，其可能的机理是AQP3提供甘油给PLD2合成磷脂酰甘油，后者作为一种重要的脂质信号促进角质形成细胞的分化［14］。研究表明，异常的AQP3/PLD2信号与皮肤肿瘤的增殖有关，AQP3和PLD2的协同作用可能对皮肤肿瘤的发生更为重要［4］。在本研究中AQP3-siRNA和PLD2-siRNA转染对于A431细胞增殖的抑制作用在48 h达到最大，在72 h有所降低，分析原因可能有两个：一是在本实验条件下，所设计的siRNA在72 h时已经有部分降解，二是A431细胞本身有一定的增殖规律。在接下来的实验中，我们将进一步研究联合转染AQP3-siRNA和PLD2-siRNA对A431细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响以及这种影响的具体机制和作用环节。

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2013-12-11）

（本文编辑：尚淑贤）

Effects of interference with the expressions of aquaporin 3 and phospholipase D2 by small interfering RNAs on the proliferation and apoptosis of a human cutaneous squamous cell carcinoma cell line A431

Wang Xiaoyong,Tao Chengjun,Yuan Chengda,Wang Minlei,Ying Hangyu,Ren Jinping.Department of Dermatology,Hangzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine,Hangzhou 310007,China

；Wang Xiaoyong,Email；wangxiaoyong1974@163.com

ObjectiveTo investigate the effects of aquaporin 3（AQP3）and phospholipase D2（PLD2）on the proliferation and apoptosis of a human cutaneous squamous cell carcinoma cell line A431.MethodsThree small interfering RNAs（siRNAs）were constructed targeting the AQP3 and PLD2 genes separately,and transfected into A431 cells using liposomes.Then,fluorescence quantitative PCR was performed to find the most efficient siRNAs.Western blot was conducted to detect the protein expression levels of AQP3 and PLD2 in A431 cells after transfection with the selected AQP3-siRNA and PLD2-siRNA.Some A431 cells were divided into five groups；normal control group without any treatment,transfection reagent group treated with the oligofectamine reagent only,negative control group transfected with the negative control siRNA,AQP3-siRNA group transfected with the selected AQP3-siRNA,PLD2-siRNA group transfected with the selected PLD2-siRNA.After additional culture,cell counting kit-8 assay was performed to evaluate the proliferation of A431 cells,flow cytometry to detect the apoptosis of A431 cells after annexin V-fluorescein isocyanate/propidium iodide double-staining.Statistical analysis was carried out by the pairedttest.ResultsThe transfection with AQP3-siRNA and PLD2-siRNA induced a significant decrease in the mRNA and protein expressions of AQP3 and PLD2 respectively in A431 cells when compared with the untransfected cells.Compared with the negative control group,the proliferation of A431 cells was significantly decelerated at 24,48 and 72 hours after transfection in the AQP3-siRNA group（t=24.10,11.00,9.54,respectively,allP＜0.01）and PLD2-siRNA group（t=30.47,7.02,8.73,respectively,allP＜0.01）.A significant increase was observed in the apoptosis of A431 cells at 48 and 72 hours after transfection with AQP3-siRNA（t=11.36,20.91,respectively,bothP＜ 0.01）,and at 72 hours after transfection with PLD2-siRNA（t=4.86,P＜ 0.05）compared with the negative control group.ConclusionThe down-regulation of AQP3 and PLD2 expressions by siRNA can inhibit the proliferation,but induce the apoptosis,of A431 cells.

Aquaporin 3；Phospholipase D；RNA，small interfering；Carcinoma,squamous cell；Cell line,tumor

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.011.002

2012年浙江省自然科学基金（LY12H11010）

310007杭州市中医院皮肤科

王小勇，Email：wangxiaoyong1974@163.com