甘草酸标准样品的研制

王岱杰，周晓晶，王尉，于金倩，王晓，李强，耿岩玲* ，Dan Staerk

(1.山东省分析测试中心，山东济南250014;2.北京理化分析测试中心，北京100089)

甘草是我国常用大宗药材，为豆科植物甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)、胀果甘草(Glycyrrhiza inflata Bat.)或光果甘草(Glycyrrhiza glabra L.)的干燥根和根茎，具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛以及调和诸药之功效。它用于脾胃虚弱，倦怠乏力，心悸气短，咳嗽痰多，脘腹、四肢挛急疼痛，痈肿疮毒和缓解药物毒性、烈性［1］。甘草具有抗寒、耐热、耐旱以及抗盐碱等优良特性，适生性和抗逆性强，生命力旺盛，为我国干旱、半干旱地区重要的植物资源之一。甘草酸(glycyrrhizic acid)又名甘草甜素(结构式见图1)，属于三萜类化合物，是甘草中重要的化学成分，也是药典中规定的甘草、炙甘草、甘草流浸膏和甘草浸膏质量控制的重要指标［2－3］。甘草酸具有抗病毒、镇咳祛痰、抗炎和保肝等功效［4－14］，其甜度高(甜度为蔗糖的200～300倍)、热能低且安全无毒，广泛应用于食品、饮料、医药、化妆品和烟草等行业。截至目前，我国尚无甘草酸标准样品，市场上销售的甘草酸对照品纯度也参差不齐。因此，为了满足药材及成药分析检测及质量控制工作的需求，保证检测结果的准确性、可比性和溯源性，本文制备了甘草酸标准样品。

图1 甘草酸的化学结构式Fig.1 Chemical structure of glycyrrhizic acid

1 实验部分

1.1 仪器

旋转蒸发仪R-3(瑞士BUCHI公司);SCIENTZ-10N冷冻干燥仪(宁波新芝生物科技股份有限公司);Agilent 1260高效液相色谱仪(美国Agilent公司);Agilent 6520 Q-ToF液质联用仪(美国Agilent公司);WRS-1B数字熔点仪(上海精密科学仪器有限公司);UV-2550型紫外可见分光光度计(日本岛津公司);INOVA 600 MHz核磁共振波谱仪(美国Varian公司);Agilent 6520 Q-ToF液质联用仪(美国Aglient公司);Vario EL III全自动元素分析仪(德国ELEMENTAR公司)。

1.2 原料与试剂

柱色谱用硅胶、薄层色谱用硅胶GF254板(青岛海洋化工厂);HPLC用乙腈、甲醇为色谱纯(美国天地公司);乙酸乙酯、丁酮、甲酸、氯仿、甲醇、盐酸等均为分析纯(天津市广成化学试剂有限公司);水为去离子水;10%甘草酸提取物(甘肃泛植生物科技有限公司)。

1.3 样品制备

质量分数10%甘草酸提取物水溶解，稀盐酸调pH值至2.0，过滤沉淀，室温晾。硅胶柱色谱进行分离，氯仿/甲醇梯度洗脱，分部收集甘草酸组分，薄层色谱跟踪监测。较纯组分放置于通风橱内，乙醇重结晶，过滤并干燥。

1.4 纯度分析方法

等度HPLC分析条件:C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱;流动相:乙腈-0.5%乙酸水溶液(38:62，V/V);流速:1.0 mL/min;柱温:30℃;运行时间:30 min;检测波长:237 nm。

梯度HPLC分析条件:C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱;流动相:A为乙腈，B为0.5%乙酸水溶液;梯度洗脱:0～20 min，38%A;20 ～40 min，38%A ～100%A;40 ～50 min，100%A;流速:1.0 mL/min;柱温:30℃;运行时间:50 min;检测波长:237 nm。

薄层色谱条件:乙酸乙酯-水-甲酸(6:1:1，V/V)和氯仿-甲醇-甲酸(4:1:1，V/V)，荧光检测和硫酸乙醇显色剂检测。

MS条件:ESI电喷雾离子源，毛细管电压4.0 kV;载气:普氮;载气流速:10 L/min;载气温度:300℃，扫描范围为m/z=100～1000。

1.5 结构表征

采用UV、IR、MS和NMR等方法对甘草酸进行结构表征。

1.6 均匀性检验

1.7 稳定性检验

考察两周内甘草酸样品甲醇、乙腈两种溶剂的稳定性。甘草酸样品于2～8℃保存，以2年为期，对制备的甘草酸样品每6个月取样检验，按1.4等度HPLC分析，以面积百分比读取样品的纯度值，每份试样以测定5次的平均值为其定值结果，用t检验对数据进行统计分析［15］。

1.8 定值

按照标准样品工作导则，采用多个实验室协作实验定值，参加实验室的数目为8个［15－18］。随机抽取24瓶样品，每个定值实验室送3瓶，每瓶平行测定2次。定值实验室将样品配成一定浓度的溶液，高效液相色谱仪测定，采用峰面积归一化法进行纯度定值。

2 结果与讨论

2.1 纯度分析

分别采用等度和梯度HPLC对甘草酸样品进行洗脱，DAD检测器进行3D扫描，扣除溶剂峰，扫描色谱图未见明显杂质色谱峰。237 nm检测波长下，对甘草酸样品色谱峰进行面积归一化定量，扣除溶剂峰，等度和梯度HPLC纯度分别为99.32%和99.35%。从薄层色谱图看，乙酸乙酯-水-甲酸(6:1:1，V/V)和氯仿-甲醇-甲酸(4:1:1，V/V)展开体系的Rf值分别为0.85和0.64，荧光检测和硫酸乙醇显色剂检测未见明显杂质。通过考察甘草酸正离子模式和负离子模式的总离子流图，未见明显杂质峰。

2.2 结构表征

采用UV，IR，MS和NMR 等方法对甘草酸进行结构鉴定，数据如下。UV λEtOHmax:237.2 nm;IR υcm－1max:3 398(νOH)，2 949(νCH)，1 715(νC=O)，1 656(νC=C)，1 455，1 370(νCH)，1 080，1 045(νCO);ESI-MS:m/z 823.412 0［M+H］+，845.393 2［M+Na］+，821.387 3［M －H］－。1H 和13C-NMR数据见表1、表2。以上数据与文献［19］比较，确定为甘草酸(Glycyrrhizic acid)。

表1 甘草酸的核磁共振氢谱数据(氘代溶剂DMSO-d6)Table 1 The1H-NMR data of glycyrrhizic acid(DMSO-d6)

表2 甘草酸的核磁共振碳谱数据(氘代溶剂DMSO-d6)Table 2 The13C-NMR data of glycyrrhizic acid(DMSO-d6)13C

2.3 均匀性检验

以F检验，确定甘草酸标准样品的均匀性数据是否附合正态分布。其结果见表3～5。

表3 均匀性检验结果(%)Table 3 Homogeneity test result(%)

表4 每瓶的平均值、方差和测量次数Table 4 Mean value，variance and measurement numbers for every bottle

表5 均匀性研究的方差分析结果Table 5 Variance analysis of homogeneity test

瓶间方差用下式计算

瓶间标准偏差为

重复性标准偏差可由MSwithin计算

均匀性引入的不确定度为

从表5可见，以 υ1(即组间)=9及 υ2(即组内)=20查 F界值表，得 F0.05(9，20)=2.94，由于F=MS间/MS内=1.41＜F0.05(9，20)，因此研制的甘草酸标样样品是均匀的。

2.4 稳定性检验

用t检验对数据进行统计分析，采用直线作为经验模型，观察斜率值是否有显著变化，以此对标准样品的稳定性变化进行预测，稳定性检验结果见表6。

表6 稳定性检验结果Table 6 Stability test result

斜率按下式计算

截距由下式计算

直线上的点的标准偏差可由下式计算

则s=0.03%，与斜率相关的不确定度用下式计算

自由度为n－2和p=0.95(95% 置信水平)的分布t因子为

由于

即|b1|＜0.006 4%，因此斜率的变化不显著，即甘草酸标准样品在2年内未观测到明显的不稳定性。

稳定性的不确定度。

2.5 定值

根据高效液相色谱法峰面积归一法所得全部测定结果，计算出甘草酸标准样品的标准值。定值结果见表7。

根据表7数据计算测定结果的总平均值

表7 甘草酸纯度定值结果及不确定度(%)Table 7 Purity certification results of glycyrrhizic acid and its uncertainty(%)

实验室平均值的标准偏差

总平均值标准偏差

多家定值引入的不确定度

研制的标准样品定值结果的不确定度由以下几部分组成:

(1)均匀性检验引入的不确定度;

(2)稳定性检验引入的不确定度;

(3)多家定值引入的不确定度。

各不确定度分量互不相关，因此合成不确定度

代入数据计算得u=0.005 9%。

置信区间95% 时，k=2，则扩展不确定度U=2 u=0.005 9% ×2=0.12%。

3 结论

本研究针对甘草酸缺乏国家实物标样的现状，进行了甘草酸标准样品的研制。根据GB/T15000.3-2008标准样品工作导则，对制备的样品进行了均匀性、稳定性及定值研究。制备出标准值为99.29%、扩展不确定度(95%置信区间)为0.12%的甘草酸标准样品，建立了甘草酸标准样品的制备方法，该标准样品符合国家一级标准样品的技术规范要求，填补了国内该领域的研究空白。该标准样品的研制可满足甘草药材及成药分析检测、质量控制工作的需求，为其检测结果的准确性、可比性和溯源性提供技术支撑和量值溯源保证。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版一部［M］.北京:化学工业出版社，2010:80－81.

［2］国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版一部［M］.北京:化学工业出版社，2010:81.

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