溃疡性结肠炎大鼠结肠中GABA的变化及其受体的表达

鲁兵，余万桂 （长江大学医学院，湖北，荆州434023）

吴国栋 （荆州市第二人民医院消化内科，湖北，荆州434000）

溃疡性结肠炎是一种发病于大肠，呈连续性弥漫分布的非特异性炎性疾病。西方国家发病率较高，亚洲国家相关较低［1］。近年来我国溃疡性结肠炎发病率逐年上升，其机制尚未研究清楚。γ－氨基丁酸（GABA）作为一种异质性神经递质，主要在突触参与的兴奋／抑制平衡中起重要重用，它在人体中枢神经系统中分布广泛［2］，有研究表明GABA在大肠中有表达。我们的前期研究表明外源性GABA可以影响大鼠大肠运动功能，导致大鼠大肠平滑肌收缩抑制。构建标准的溃疡性结肠炎动物模型，对探讨该疾病的发生、发展及其发病机制具有重要意义。本实验采用3%硫酸葡聚糖诱导构建大鼠溃疡性结肠炎，检测大鼠结肠组织中GABA的浓度以及GABA受体的表达变化，为探讨溃疡性结肠炎发病机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

雄性Wistar大鼠17只，体质量（175g±15）g，PF级，由湖北省实验动物研究中心提供（动物中心许可证号为SCXK2008－005，动物合格证号：00003033）。饲料由湖北省实验动物研究中心提供，常规饲养。DSS，购置于上海西宝生物科技有限公司；GABA、GABAA受体和GABAB受体由SIGMA公司提供；免疫组织化学SP试剂盒、DAB显色试剂盒购自福州迈新生物制品有限公司。日本Shimadzu公司的高效液相色谱仪，上海博迅公司的水浴恒温振荡器和低温高速离心机。

1.2 方法

1.2.1 实验分组与取材 将大鼠分为实验组以及对照组，对照组每天自由饮用蒸馏水，实验组自由饮用含3%DSS的蒸馏水7d诱导建立大鼠溃疡性结肠炎模型。所有大鼠经乌拉坦麻醉后，断头处死，分离结肠，沿肠系模附着处纵行剪开肠壁，观察大体形态改变。

1.2.2 γ－氨基丁酸标准液以及样本液的制作 称重0.1g大鼠结肠样品于100ml三氯乙酸溶液，在40℃水浴中摇荡120min，冷却及静置，低速离心取大肠组织上清液。称重γ－氨基丁酸标准品10mg放置于100ml容器中，蒸馏水定容，可以得到溶度为100mg／ml标准溶液，将其稀释100倍得到浓度为1ug／ml的γ－氨基丁酸标准溶液。

1.2.3 结肠组织GABAA受体和GABAB受体免疫组化测定 石蜡切片按照SP试剂盒说明书进行免疫组织化学染色，以PBS代替一抗作阴性对照，DAB显色，苏木素衬染，中性树胶封固。ImagePro Plus 6.0医学图像分析系统（Media Cybernetics，USA）光镜下（×400）分析免疫组化切片，对各切片中各抗体不透光率密度（Opacity Density，OD）半定量分析，以OD数值代表染色强度，OD数值越大，染色强度越大。

1.2.4 结肠组织中GABA含量的测定

1）色谱条件。Shimadzu公司色谱柱；流动相：0.04mol／L乙酸钠：甲醇＝65∶35；流速1.5ml／min；柱温36℃；荧光测仪：发色波长为380nm，激发波长为250nm，进量为30μl，以GABA峰面积来定量。

2）流动相。称量3.4g三水合乙酸钠，采用双蒸水溶解定容至500ml，滤膜过滤，使用超声清洗器30min脱气。

3）衍生试剂的配制。邻苯二甲醛（OPA）250mg溶解于5ml甲醇中，采用0.5mol／L四硼酸钾溶液稀释至150ml，放入2－MCE 200μl，摇匀，放置于4℃冰箱中备用。

4）标准液以及大肠样液的处理。取1ml样液及标准液GABA溶液，加入OPA 2ml，反应4min，滤膜过滤至瓶中然后进行分析。测定GABA标准曲线以及样品液密度测定并计算出其回收率。

2 结果

2.1 GABAA受体和GABAB受体的免疫组化表达

对照组大鼠结肠上皮GABAA受体和GABAB受体免疫阳性反应主要定位于腔面顶部和隐窝上皮细胞的胞质呈零星表达，棕黄色，此外肌层中肌间神经丛的神经纤维亦可涉及。与对照组比较，模型组溃疡面上皮脱失，GABAA受体免疫阳性反应主要定位于附近残存的腺上皮细胞胞质，以及肉芽组织的间质细胞胞质中，此外肌层中肌间神经丛的神经纤维亦可涉及，其表达明显增强（图1、图2）。OD数值明显升高（P＜0.01），GABAB受体表达依然零星，与正常组无明显差异（P＞0.05）（表1）。

表1 两组大鼠结肠GABAA受体和GABAB受体表达OD值

2.2 GABA浓度测定结果

2.2.1 标准GABA溶液与大鼠大肠样液的分离 在1.5色谱条件下，Shmadzu色相柱上对衍生的GABA标准品与大鼠样品组分进行了分离。GABA标准品保留时间为12.328min，模型组大鼠大肠样品的GABA分离时间为12.857min，对照组大鼠大肠样品的GABA分离时间为12.795min，大鼠大肠中其他成为不干扰GABA的测定。

2.2.2 衍生反应时间 OPA试剂与GABA的反应程度与衍生反应时间之间存在关联。如衍生反应时间过短，反应不充分，反应时间过长，分离产物破坏，会影响检测的精确性。本实验衍生反应时间确定为2min。

图1 结肠组织病理学改变（HE，×400）

图2 结肠组织GABAA受体的表达（SP，×400）

2.2.3 标准曲线系数确定 取 GABA标准液配置成浓度为0.2、0.4、0.8、1.6μg／ml。移取1ml与OPA1ml混匀，进行分析，纵坐标是峰面积，浓度为横坐标，进行线性回归，其表示出良好的线性关系，系数为0.997。

2.2.4 回收率及精密度 在1.5色谱条件下，模型组与对照组4个浓度的回收率见表2。实验重复5次，计算出日内精密度和日间精密度（见表3）。

2.2.5 浓度结果 实验组大鼠大肠组织内GABA浓度为（698.6±23.5）ng／ml，正常组大鼠大肠组织内GABA浓度为（220±15.9）ng／ml，实验组 GABA 含量为（698.6±23.5）ng／ml，对照组为（20.0±15.9）ng／ml，实验组高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表2 实验组与正常组GABA回收率

表3 实验组与正常组精密度

3 讨论

溃疡性结肠炎是一种不明原因介导的非特异性炎症，主要病变部位在结肠，分布呈连续弥漫性。目前其发病机制尚不清楚，多种因素可引起溃疡性结肠炎。目前主流的学说导致溃疡性结肠炎的有遗传学说、环境学说、微生物学说以及免疫学说，他们之间相互关联［3］。随着分子生物学方面的发展进步，溃疡性结肠炎在分子水平方面的研究取得很大进展。

γ－氨基丁酸作为一种异质性神经递质，主要在突触参与的兴奋／抑制平衡中起重要重用，它在人体中枢神经系统中分布广泛［4］。GABA有三种亚型，分别是GABAA、GABAB以及GABAC三种受体。有研究表明采用免疫组化法研究大肠GABA受体时三种受体均表达。我们的前期研究表明外源性GABA可以影响大肠运动功能，导致大鼠大肠平滑肌收缩抑制。也有大量研究表明外源性GABA还可以影响大肠的分泌功能。

本实验通过构建溃疡性结肠炎大鼠模型，离体大鼠结肠，采用高效液相色谱法测定结肠中GABA的含量，发现模型组较正常组大鼠中GABA含量明显增高。有研究报道指出，结肠中GABA受体分为GABA有三种亚型，分别是GABAA、GABAB以及GABAC三种受体。但GABA可以同时与三种受体相结合，不同受体与GABA结合后激活表现出不同的生理作用。GABA作用于大肠主要以GABAA受体激活表现的大肠平滑肌收缩抑制为主。我们前期研究发现了类似的结果。

GABA在脑内由谷氨酸脱羧经由GABA旁路生成，构型灵活多变，以两性离子的形式存在，可与多种受体结合发挥多种生理功能。其受体主要可分为两类：即GABAA受体和GABAB受体［5］。GABA不仅是大脑中主要的抑制性神经递质，还对中枢神经系统以外的多种组织的形态发生及成熟起重要作用［6］。GABA不仅能通过GABAA受体影响肝细胞的再生活性［7］，还能影响前列腺癌以及结肠癌细胞的增殖活性［8－9］。GABAB受体则主要在上皮细胞的恶性转化、浸润及转移的过程中起作用［9－10］，亦可在GABA诱导肿瘤细胞凋亡过程中起到重要作用。在本试验中，可以观察到GABAA受体和GABAB免疫阳性反应主要定位于腔面顶部和隐窝上皮细胞的胞质中，呈棕黄色零星表达，定位与相关文献报道一致。在UC模型中，GABAA受体免疫阳性反应主要定位于附近残存的腺上皮细胞胞质以及肉芽组织的间质细胞胞质中，此外肌层中肌间神经丛的神经纤维亦可涉及，亦与相关报道吻合。在UC模型中，GABAA受体表达增强，GABAB的表达却未明显增强的情况，可能说明GABA主要是通过GABAA受体介导细胞内钙离子浓度升高，诱导细胞膜去极化，抑制DNA合成，从而降低UC上皮细胞的修复性增生活性。

总之，通过本次试验进一步证实了溃疡性结肠炎的发生发展与GABA密切相关。GABA主要通过其GABAA受体参与溃疡性结肠炎的病理生理过程。这对临床上针对溃疡性结肠炎的GABA受体阳性表达的患者特异性治疗提供了理论依据。

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