ITP患儿B细胞激活因子与血小板相关抗体的相关性分析

张军红，许华平，雷中劲（荆门市第一人民医院儿科，湖北 荆门448000）

儿童出血性疾病中最常见的是免疫性血小板减少性紫癜（ITP），其发病率为0.25／万～0.50／万，常以自发性出血为首发表现，查血时见血小板减少，同时存在出血时间延长及血块收缩不良。其发病机理尚未完全明确，多认为其经典的发病机制是：患者自身存在免疫缺陷，在外来抗原的刺激下，机体产生血小板相关抗体（主要包括PAIgA、PAIgG及PAIgM）。血小板相关抗体不仅使已经生成的血小板破坏增多，而且血小板相关抗体还引起骨髓中巨核细胞成熟障碍，导致血小板生成减少［1］。B细胞激活因子（BAFF）又称BLyS，是1999年发现的TNF家族新成员，在免疫机制中起着重要作用。它能与B淋巴细胞特异性结合并诱导其增生、分化并分泌免疫球蛋白，在体液免疫中有着重要地位［2］。BAFF过量表达会破坏免疫耐受，故其在自身免疫性疾病如SLE的发病过程中扮演着重要角色。

本课题组前期的研究发现：与ITP治疗后组及对照组相比较，治疗前BAFF的表达明显增高，推论在ITP患儿的发病机制中，增高的BAFF表达起着重要作用［3－4］。本研究进一步检测ITP患儿血小板相关抗体水平及BAFF的表达，探讨BAFF在ITP发病中的作用。

1 对象与方法

1.1 对象

ITP患儿为实验组，共40例，2010年4月至2013年4月初次在本院儿科住院治疗，女18例，男22例，年龄4岁7月～13岁8月，平均年龄4岁7月，所有患儿符合《血液病诊断及疗效标准》［5］。治疗前血小板计数为（4～32）×109／L。确诊后予肾上腺皮质激素治疗，其中28例加用丙种球蛋白（1g～2g／kg）冲击治疗。对照组共40例，都已排除血液系统疾病，为本院择期行腹股沟疝及隐睾等手术的患儿。其中女20名，男20名，年龄5月～10岁8月，平均年龄2岁1月。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 40例ITP患儿入院第1～2天采血，治疗后1个月采血（BPC＞100×109／L37例，50×109～100×109／L 3例）。对照组在手术前1天采血。常规抽取空腹静脉血，离心收集血清，－80℃保存待测。同时采对照组及治疗中及治疗后组患儿静脉血3ml，抗凝，按常规方法分离外周血单个核细胞，经离心后收集细胞沉淀。

1.2.2 检测 血小板相关抗体（PAIgG及PAIgM）测定采用人血小板相关抗体（上海信然公司）ELISA试剂盒检测。实时荧光定量PCR法检测外周血单个核细胞BA FF－mRNA表达：引物设计合成和标准曲线的构建，根据GenBank的序列β－actin（AY582799）以及BAFF（AL157762），应用Primer Premier 5.0软件设计引物，由达安基因公司合成。总RNA制备以及cDNA链的合成，标准曲线的建立，实时荧光定量PCR（RTqPCR）检测BAFF－mRNA表达水平按达安基因方法检测［4］。根据标准曲线，软件自动计算出待测样本中BAFF－mRNA表达量。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 血小板相关抗体水平

治疗中组血小板相关抗体含量显著高于治疗后组血小板相关抗体含量（P＜0.01）；ITP患儿治疗中组血小板相关抗体含量明显高于对照组的血小板相关抗体含量（P＜0.01）；ITP患儿治疗后组与对照组的血小板相关抗体含量相比较，两者无统计学差异（P＞0.05）。见表1。

表1 各组PAIgG、PAIgM、BAFF－mRNA比较

2.2 各组PBMCs BAFF－mRNA 表达水平

PBMCs BAFF－mRNA表达水平在治疗组中患儿明显高于治疗后组患儿和对照组，差异具有统计学意义（P＜0.01），而治疗后组患儿与对照组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

2.3 关联性分析

血小板相关抗体含量与外周血BAFF－mRNA表达水平显著相关（r＝0.685，P＜0.05）。血小板相关抗体含量与血小板数量呈负相关，治疗前患儿血小板相关抗体含量较高，但其外周血中血小板数较低；相反，经治疗后血小板数升高时其血小板相关抗体含量较前降低。

3 讨论

尽管ITP的发病机制尚未完全阐明，但已证实血小板减少的确与PAIg相关。PAIg常为分三种亚型，PAIgG、PAIgM及PAIgA。研究证明：90%以上ITP患儿血小板表面存在PAIgG，同时发现，部分患儿PAIgG和PAIgM同时存在增高表达，少数患儿PAIgA亦可增高［6］；亦有研究认为PAIgM对观察ITP的预后具有重要意义，初诊时PAIgM或合并PAIgG异常增高的患儿对常规激素等免疫抑制治疗的疗效要差于PAIgM不增高的患儿［7］。本研究还发现，ITP患儿PAIg与血小板数呈负相关，这与以前报道一致。

BAFF在体液免疫上起着重要作用，BAFF表达不足则致免疫功能减低，表达过量可破坏免疫耐受导致自身免疫性疾病。已经有大量的研究证实在SLE、干燥综合征等自身免疫性疾病的发病机制中，BAFF起着重要的作用。Szodoray等［8］研究了干燥综合征患者B淋巴细胞的凋亡情况，同时进一步研究了BAFF对相关B细胞的影响，发现干燥综合征患者的bcl－2阳性B淋巴细胞凋亡降低。并据此推论明显的抗凋亡作用可能通过BAFF和B淋巴细胞相关细胞因子介导。本研究组前期试验证实ITP患儿BAFF水平有增高表达，经治疗病情好转后下降，提示BAFF在ITP患儿的发病机制中起着重要作用［3－4］。本次研究进一步证实ITP患儿存在BAFF－mRNA增高的表达，并与血小板相关抗体相关。支持在ITP患儿，血小板相关抗体血小板破坏仍是血小板减少的主要原因，它可能通过BAFF和B淋巴细胞相关细胞因子降低B淋巴细胞的凋亡，并上调血小板相关抗体的合成来决定起病以及病情的严重程度。

吴润晖等［9］认为，急、慢性ITP患儿所处的免疫状态可能不同：①免疫状态好，在感染等因素刺激下，产生免疫监视逃逸，随病原菌清除而恢复，病程呈自限过程，此为急性ITP；②免疫失调和异常，即持久恒定的HLA－DR刺激性免疫应答使体液免疫及细胞免疫出现紊乱，即使诱发因素消失，仍不能恢复，表现为慢性ITP。慢性、难治性ITP是治疗的难点及重点，急慢性ITP发病机制是否存在差异，现正成为研究的热点。随着病例增多，将难治性ITP及慢性ITP分组作进一步的研究，这正是我们下一步研究的目标。

［1］ 秦平，候明 .特发性血小板减少性紫癜的发病机制 ［J］.国际输血和血液学杂志，2007，30（6）：494－498.

［2］ 李晓琳 .BAFF信号的免疫调节作用 ［J］.国际免疫学杂志，2006，29（6）：368－370.

［3］ 张军红，徐酉华 .特发性血小板减少性紫癜患儿血清B细胞激活因子变化的意义 ［J］.实用儿科临床杂志，2013，34（3）：195－197.

［4］ 张军红，王从军，雷中劲.B细胞激活因子在特发性血小板减少性紫癜中的表达与意义 ［J］.临床血液学杂志，2014，27（3）：216－220.

［5］ 张之南，沈悌 .血液病诊断及疗效标准 ［M］.3版 .北京：科学出版社，2007：116－121.

［6］ 李明，台虹.PAIgG，PAIgA和PAIgM在特发性血小板减少性紫癜诊断中的应用 ［J］.中国医学检验杂志，2002，2（1）：52－54.

［7］ 何飞，梁昌达 .血小板相关抗体与儿童特发性血小板减少性紫癜转归的相关性分析 ［J］.中国小儿血液肿瘤杂志，2011，16（5）：225－227.

［8］ Szodoray P，Jellestad S，Alex P，et al.Programmed cell death of peripheral blood B cells determined by laser scanning cytometry in Sjogren＇s syndrome with a special emphasis on BAFF ［J］.J Clin Immunol，2004，24：600－611.

［9］ 吴润晖 .儿童特发性血小板减少性紫癜研究进展 ［J］.实用儿科临床杂志，2007，22（3）：161－164.