靶向血管平滑肌细胞TLR4基因小干扰RNA载体构建及效果评价*

崔 丽 李广平 富华颖 王兴华 焦占全

Toll样受体4（Toll like receptor-4，TLR4）是近年来新发现的细胞跨膜受体，被认为是连接天然免疫和获得性免疫的桥梁，越来越多的证据表明TLR4介导的免疫反应参与血管复杂的炎性反应过程[1]，在动脉粥样硬化的形成和进展、再狭窄的发生[2]、心肌缺血再灌注（I/R）损伤中发挥着重要作用[3]。RNA干扰（RNAi）是一种特异性的基因沉默技术，能抑制靶基因的转录。本研究通过构建靶向TLR4基因的小干扰RNA（siRNA）真核表达载体，并建立稳定降低内源TLR4表达的血管平滑肌细胞（SMC），探讨siRNA对SMC中TLR4基因表达的抑制作用，同时为研究TLR4对血管平滑肌的细胞增殖、迁移的作用机制提供细胞模型。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 质粒、菌株及细胞 质粒pSilence 2.1-U6 neo、pSi⁃lence2.1-NC（阴性对照）及大肠杆菌DH5α（E.coliDH5α）由天津市心血管病研究所惠赠。pSilence 2.1-U6 neo质粒带有U6启动子，并包含HindⅢ及BamHⅠ2个限制性内切酶酶切位点。pSilence2.1-NC质粒的限制性内切酶酶切位点间携带无义序列作为对照。兔主动脉血管平滑肌细胞（CC-SMC）购自北京军事医学科学院协和细胞中心。

1.1.2 酶类及主要材料 限制性内切酶HindⅢ、BamHⅠ及T4 DNA连接酶，脂质体转染试剂盒（Invitrogen公司）；UNIQ-10柱总RNA抽提试剂盒（上海生工），高纯度质粒中量提取试剂盒（QIAGEN公司），鼠抗兔TLR4多克隆抗体（Abcom公司），鼠抗兔GAPDH单克隆抗体（北京贤至生物公司），辣根过氧化酶标抗鼠IgG（美国Sigma）。小发夹RNA（shRNA）寡核苷酸DNA序列合成由北京六合华大基因科技股份有限公司完成，基因测序由北京三博远志生物技术有限责任公司完成。

1.2 方法

1.2.1 TLR4 shRNA序列的设计 依据GenBank查序获得兔TLR4 mRNA序列（NM_001082732），通过BLAST分析设计针对TLR4的序列中3个特异序列作为干扰组靶序列，两端酶切位点分别为HindⅢ和BamHⅠ，序列见表1。以下将TLR4 shRNA的DNA序列称为siRNA-TLR4-1、siRNA-TLR4-2、siRNA-TLR4-3，表达上述序列的pSilence 2.1质粒称为pSilence2.1-siTLR4-1、pSilence2.1-siTLR4-2、pSilence2.1-siTLR4-3。

1.2.2 重组质粒pSilence2.1-siTLR4的构建和鉴定 选取HindⅢ、BamHⅠ的双酶切位点对质粒pSilence 2.1-U6 neo质粒进行双酶切，“V”型槽电洗脱法回收线性化的载体。用T4 DNA连接酶将线性化的pSilence 2.1-U6 neo质粒载体分别与退火后siRNA-TLR4双链片段进行连接过夜。采用CaCl2法将连接产物转化DH5α感受态细胞，涂布于氨苄抗性的LB培养平板，37℃温箱培养过夜，挑取阳性克隆摇菌并提取重组质粒。用HindⅢ、BamHⅠ分别酶切重组pSilence2.1-siTLR4质粒，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定是否连接成功，同时对酶切成功的质粒进行基因测序，测序引物序列上游：5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′。下游：5′-GAGTTAGCTCACT⁃CATTAGGC-3′。测序鉴定正确后，采用高纯度质粒中量提取试剂盒分别提取重组质粒。

1.2.3 细胞的培养和转染 SMC应用常规HG-DMEM培养液（10%FBS、100 mg/L青霉素、10 mg/L链霉素）于37℃，95%空气和5%CO2混合气体的细胞培养箱中培养；细胞生长融合达100%时，采用消化法将SMC传代至60 mm培养皿中，5×106个细胞/孔，每孔中加4 mL HG-DMEM培养液（含10%FBS，无抗生素）。次日待SMC融合50%～70%，采用阳离子脂质体法将纯化的重组质粒pSilence2.1-siTLR4-1、pSilence2.1-siTLR4-2、pSilence2.1-siTLR4-3和 pSilence2.1-NC转染SMC，按照脂质体转染试剂盒（包括LipofectamineTMLTX Re⁃agent和PLUSTMReagent）说明书操作，各皿质粒的转染量为1 μg。转染48 h后更换为含400 μg/L G418的HG-DMEM选择培养液，每3 d换液1次，待作为空白对照的未转染质粒的SMC全部死亡后，将G418浓度更改为200 μg/L维持筛选，2～3周后可见阳性克隆出现，选取孤立良好的克隆，将其消化转移至24孔板，待细胞再次形成克隆后转移至60 mm细胞培养板，扩大培养。

1.2.4 RT-PCR检测TLR4 mRNA水平 收集各组SMC，PBS洗涤细胞沉淀，UNIQ-10柱总RNA抽提试剂盒提取细胞总RNA，紫外分光光度法检测总RNA纯度并定量，取总RNA 1 μg逆转录合成cDNA。扩增特异的TLR-4序列，扩增引物上游：5′-TTCAAGGGCTGAGTGGT-3′。下游：5′-CGAGGT⁃CATCTATGTATGCT-3′；反应体系（25 μL）：dNTP（各 2.5 mmol/L）0.5 μL，20 μmol/L TLR-4上、下游引物各0.5 μL，GAP⁃DH上、下游引物各0.1 μL，Taq DNA聚合酶1.0 U，5×Buffer[75 mmol/L(NH4)2SO4，300 mmol/LTris-HCl，MgCl21.5 mmol/L，pH 9.5]5 μL，ddH2O 17.05 μL，模板cDNA 1 μL。循环反应条件：94℃预变性5 min；94℃ 变性30 s，55℃ 退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸7 min；3%琼脂糖凝胶，100 V电泳40 s，分离PCR扩增产物，3%琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物，Gel-pro 3.1凝胶成像分析系统对凝胶进行扫描，测定TLR4及GAPDH表达条带的灰度值，两者灰度比值（TLR4/GAPDH）作为TLR4 mRNA的相对表达量。

1.2.5 Western blot检测TLR4蛋白的表达 收集各组SMC，PBS洗涤细胞沉淀，RIPA细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂）裂解细胞，按照考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒说明书测定蛋白浓度，将蛋白浓度均一化为1.2 g/L，取20 μL总蛋白样品，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，电转移至硝酸纤维素膜上，PBS Buffer洗膜3次，分别加入1∶500稀释的TLR4鼠抗兔多克隆抗体和1∶500稀释的GAPDH鼠抗兔单克隆抗体，37℃震荡1 h，4℃过夜。洗膜、1∶4 000羊抗鼠二抗孵育2 h，洗膜、显色、X线片曝光，扫描并摄取图像，使用TotalLab分析底片上条带，以TLR4/GAPDH灰度比值作为TLR4蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 重组siRNA-TLR4表达质粒的鉴定结果 DNA测序证实重组质粒pSilence2.1-siTLR4-1、pSi⁃lence2.1-siTLR4-2、pSilence2.1-siTLR4-3中插入的siRNA-TLR4基因片段未出现碱基突变、错配等异常，基因序列完全正确。

2.2 不同重组质粒转染对SMC TLR4 mRNA抑制效率 阴性对照质粒pSilence-2.1-NC转染对SMC TLR4 mRNA表达无影响，与空白对照组细胞相比差异无统计学意义（P＞0.05），而TLR4-siRNA的3个重组质粒转染后筛选的SMC中TLR4 mRNA表达较正常及阴性对照质粒明显降低（P＜0.05），其中以pSilence2.1-siTLR4-1的抑制作用最强，见表2。

Table1 Specific target sequences for TLR4 siRNA and synthesized shRNA oligonucleotides表1 TLR4的靶序列及合成的shRNA oligo DNA序列

Table 2 The expression of TLR4 mRNA in transfected SMCs表2 质粒转染后SMC中TLR4 mRNA表达情况（±ss）

Table 2 The expression of TLR4 mRNA in transfected SMCs表2 质粒转染后SMC中TLR4 mRNA表达情况（±ss）

＊Plt;0.05，＊＊Plt;0.01

q组别空白对照组(1)pSilence2.1-NC组(2)pSilence2.1-siTLR4-1组(3)pSilence2.1-siTLR4-2组(4)pSilence2.1-siTLR4-3组(5)F n 3 3 3 3 3 TLR4 mRNA表达量1.27±0.08 1.21±0.04 0.33±0.12 0.41±0.05 0.53±0.05 107.8＊＊统计学处理组比(1)∶(2)(1)∶(3)(1)∶(4)(1)∶(5)(2)∶(3)(2)∶(4)(2)∶(5)1.341 21.019*19.230*16.547*19.677*17.889*15.205*

2.3 不同重组质粒转染对SMC细胞TLR4蛋白表达抑制效果 与空白对照组相比，阴性对照质粒pSi⁃lence2.1-NC转染后SMC中TLR4蛋白表达水平差别不明显，重组质粒转染后的SMC中TLR4蛋白表达水平明显低于空白对照组及pSilence2.1-NC组，其中pSilence2.1-siTLR4-1组、pSilence2.1-siTLR4-2组、pSilence2.1-siTLR4-3组TLR4蛋白表达水平分别降低为空白对照组的30%、42%和66%，其中质粒pSilence2.1-siTLR4-1的抑制效果最好，见图1。

3 讨论

3.1 Toll样受体4的功能 Toll样受体4作为跨膜蛋白受体，其组织分布广泛，除单核/巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞（DC）外，在心血管系统中的心肌细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞以及外膜的成纤维细胞均有表达，主要特异性地识别、结合病原相关分子模式（PAMPs）[4]，并通过髓样分化蛋白88（MyD88）依赖性和非依赖性途径由胞外向胞内传导信号，参与促炎反应、促进免疫细胞成熟分化及免疫应答的调节。研究表明，活化的TLR4可通过激活核因子（NF）-κB，诱导产生炎症因子白细胞介素（ILs）、肿瘤坏死因子（TNF）-α、黏附因子（VCAM）-1及趋化因子（MCP）-1等多种因子促进SMC增殖并参与血管炎症反应。Otsui等[4]研究发现，冠心病患者冠状动脉SMC中TLR4的表达明显上升；Versteeg等[5]研究显示不稳定型心绞痛患者TLR4及其介导的信号通路因子表达上调，介入治疗后TLR4表达下降，表明TLR4可作为稳定型心绞痛患者发生心肌缺血的潜在标志物。此外，抑制TLR4的表达可减弱动脉损伤后的SMC和血管重塑[6]，因此抑制TLR4的表达有可能成为防止动脉粥样硬化和再狭窄的有效靶点。

3.2 siRNA表达载体构建的意义 RNA干扰是真核生物基因转录后沉默的重要机制之一，通过导入外源双链RNA，引起生物体或细胞内同源mRNA降解，从而发生序列特异性基因沉默，已成为研究基因功能、基因治疗和寻找药物靶点的重要工具。本研究分别选取TLR4 mRNA的3段21个寡核苷酸序列作为干扰片段，合成小发夹双链RNA质粒载体并成功转染入SMC，在细胞RNA聚合酶Ⅲ的作用下释放出siRNA短片段，诱导靶向TLR4 mRNA降解。本实验中，经RT-PCR及Western blot证实siRNA组TLR4 mRNA及蛋白表达明显低于空白对照组，表明TLR4-siRNA对TLR4 mRNA及蛋白表达水平均具有抑制作用，其中pSilence2.1-siTLR4-1的抑制作用最强，提示RNAi能有效下调血管SMC中TLR4基因的表达。同时通过G418抗性筛出稳定下调TLR4基因表达的血管SMC，为下一步研究TLR4对血管SMC增殖、迁移的作用机制提供了细胞模型，有助于深入探讨TLR4在动脉粥样硬化及再狭窄中的作用。

Figure 1 TLR4 protein expressions in transfected SMC cells图1 各组质粒转染后SMC中TLR4蛋白表达情况

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