正交试验优选杜仲叶绿原酸的提取工艺

王柏强，刘福，江承平，何效平，曾芝兰（.川北医学院附属医院药剂科，四川南充637000；2.川北医学院药学院，四川南充 637000）

杜仲（Eucommia ulmoidesOliv.）是我国特有的名贵中药材，传统用药以皮为主，但剥皮后树体容易死亡。现代研究表明，杜仲叶与皮所含化学成分基本相同[1]，且叶中部分有效成分比皮还要高[2]。杜仲叶具有补肝肾、强筋骨的作用，用于治疗肝肾不足、头晕目眩、腰膝酸痛、筋骨痿软等证[3]。本研究在众多理论基础上，采用超声联合纤维素酶法提取杜仲叶绿原酸，通过正交试验确定最优提取工艺。因杜仲叶中的有效成分主要存在于细胞壁包被的叶细胞内[4]，故首先用纤维素酶水解杜仲叶细胞壁，再联合超声辅助提取法对杜仲叶绿原酸进行高效提取，最大限度地利用杜仲叶资源，为其工业化生产提供参考。

1 材料

1.1 仪器

10 A型高效液相色谱仪，包括SPD-10A型紫外检测器（日本岛津公司）；SHZ-DⅢ型循环水式真空泵（巩义市英峪予华仪器厂）；PHS-SB型pH计（成都瑞驰分析控制仪器有限公司）；760型CRT双光束紫外-可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）；TP-114型电子分析天平（德国赛多利斯公司）；SB-25-12DT型超声波提取器（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 药材

杜仲叶，购自重庆医药公司，经川北医学院药学院李生茂讲师鉴定为真品。

1.3 试剂

纤维素酶（上海伯奥生物科技有限公司，活性：≥15 U/mg）；绿原酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号：0753-200111）；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 绿原酸含量的测定

2.1.1 色谱条件色谱柱：Hypersic C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.4%磷酸溶液（13∶87，V/V）；流速：1.0 ml/min；检测波长：327 nm；柱温：室温。

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取干燥至恒质量的绿原酸对照品13 mg，置100 ml量瓶中以50%甲醇溶解并定容至刻度，即得0.13 mg/ml对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备 准确称取杜仲叶粉末10 g，加入pH4 NaAc-HAc缓冲液120 ml、纤维素酶20 mg，置40℃水浴中酶解30 min后再于50℃超声提取30 min，滤过，精密吸取滤液0.5 ml，置10 ml量瓶中，以50%甲醇稀释并定容至刻度，0.45µm微孔滤膜滤过，即得。

2.1.4 标准曲线的制备 精密量取对照品溶液1、3、5、8、10 ml，置10 ml量瓶中，以50%甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，0.45µm微孔滤膜滤过，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定。以峰面积值积分值（y）为纵坐标，进样质量浓度（c）为横坐标，进行线性回归，得回归方程为y＝31 860c+27 633（r＝0.999 9，n＝5）。结果表明，绿原酸质量浓度在1.3～130µg/ml范围内与峰面积积分值呈良好线性关系。

2.2 不同提取方法比较[5-8]

准确称取杜仲叶粉末10 g，采用不同溶剂、不同提取方法进行考察。采用乙醇超声提取法和超声纤维素酶法所得的绿原酸提取率相对较高，但乙醇超声提取需要有机溶剂，生产成本高；而采用超声纤维素酶法提取，更节省能源，更适合工业化生产。不同提取方法比较结果见表1。

表1 不同提取方法比较（n＝3）Tab 1 Comparison of different extraction methods（n＝3）

2.3 单因素试验

2.3.1 酶解pH考察 适当的pH可维持酶活性中心最佳构象，促进酶与底物结合；pH不同会导致酶与作用底物所带电荷不同，使得酶与底物的亲和力不同，从而催化速度也不同。由考察结果可知，在pH＝4.5时，绿原酸提取率最高，随着pH再升高，绿原酸的提取率逐渐下降。酶解pH对绿原酸提取率的影响见图1。

图1 酶解pH对绿原酸提取率的影响（n＝3）Fig 1 Effects of pH of Enzymatic hydrolysis on the yield of chlorogenic acid（n＝3）

2.3.2 酶解时间考察 酶解时间与酶促反应进行程度密切相关，反应时间太短，酶解不充分。在考察范围内随着酶解时间的增加，绿原酸的提取率呈逐渐增加的趋势。当绿原酸提取率达到一定值后，酶促反应时间的延长并不能明显增加提取率。为节省时间，选择酶解时间为60 min。酶解时间对绿原酸提取率的影响见图2。

2.3.3 酶解温度考察 随着酶解温度升高绿原酸提取率逐渐增大，达到40℃后继续升高温度，绿原酸提取率反而呈现不同程度的下降。主要原因是酶促反应中，合适的温度能使酶保持最大活性，同时也有利于提取介质扩散；温度过高，不仅导致绿原酸氧化分解，也会使酶蛋白变性。所以，提取温度在30～50℃之间较为适宜。酶解温度对绿原酸提取率的影响见图3。

图2 酶解时间对绿原酸提取率的影响（n＝3）Fig 2 Effects of time of Enzymatic hydrolysis of pH on the yield of chlorogenic acid（n＝3）

图3 酶解温度对绿原酸提取率的影响（n＝3）Fig 3 Effects of temperature of Enzymatic hydrolysis on the yield of chlorogenic acid（n＝3）

2.3.4 酶用量考察 随着纤维素酶用量的增加，绿原酸提取率明显增加，当酶的用量增加到20 mg时，酶分子逐渐趋于饱和，提取液中绿原酸的含量增加速度变慢。酶用量对绿原酸提取率的影响见图4。

图4 酶用量对绿原酸提取率的影响（n＝3）Fig 4 Effects of consumption of Enzymatic hydrolysis on the yield of chlorogenic acid（n＝3）

2.3.5 固液比考察 固液比过小时，溶液黏度大、滤过困难；在固液比为1∶15（g/ml）时，绿原酸提取率最大，而固液比过大，导致体系中酶的浓度降低，影响绿原酸提取效果，同时滤过费时，还会给后续纯化工艺带来困难。固液比对绿原酸提取率的影响见图5。

图5 固液比对绿原酸提取率的影响（n＝3）Fig 5 Effects of the ratio of solid to liquid on the yield of chlorogenic acid（n＝3）

2.3.6 超声提取时间考察 超声提取初期，绿原酸提取率随着超声时间的延长而逐渐升高，至超声处理40 min时，绿原酸提取率达最大值，而后绿原酸含量随时间的延长逐渐降低。超声提取时间对绿原酸提取率的影响见图6。

图6 超声提取时间对绿原酸提取率的影响（n＝3）Fig 6 Effects of dosage of ultrasonic time on the yield of chlorogenic acid（n＝3）

2.3.7 超声提取温度考察 超声提取温度对绿原酸提取率影响也较大，随温度的升高，绿原酸提取率呈增加趋势，同时杂质溶出量也相应增大，温度过高活性成分易被破坏。为了避免长时间高温下绿原酸被氧化分解，以及提高提取操作效率，超声提取温度在50℃左右较为适宜。超声提取温度对绿原酸提取率的影响见图7。

图7 超声提取温度对绿原酸提取率的影响（n＝3）Fig 7 Effects of dosage of ultrasonic extraction temperature on the yield of chlorogenic acid（n＝3）

2.4 正交试验优选提取工艺

在单因素考察基础上，以超声提取时间（A）、固液比（B）、酶解温度（C）、酶用量（D）为考察因素，绿原酸提取率为考察指标，采用L9（34）正交表进行试验。因素与水平见表2；正交试验结果见表3；方差分析结果见表4。

表2 因素与水平Tab 2 Factors and levels

由表3、表4可以看出，4个因素对绿原酸提取率的影响趋势与单因素考察结果基本一致，因素影响的大小为固液比＞超声提取时间＞酶解温度＞酶用量。在考察范围内，就绿原酸提取率而言，固液比与超声提取时间为显著性影响。根据正交试验和方差分析结果确定最佳工艺条件为A2B2C3D2，即超声提取时间40 min，固液比1∶15（g/ml），酶解温度45 ℃，酶用量20 mg。

2.5 工艺验证试验

为考察最佳工艺条件的重现性，按最佳工艺条件重复试验6次。结果，绿原酸的平均提取率为2.37%，RSD＝2.8%（n＝6），说明优选的工艺合理、可行，重现性较好。

表3 正交试验结果Tab 3 Results of orthogonal test

表4 方差分析结果Tab 4 Results of variance analysis

3 讨论

笔者对不同提取方法与不同提取溶剂进行初步考察发现，以乙醇超声提取法和超声纤维素酶法中绿原酸提取率相对较高。乙醇回流提取杂质多[5]，不易滤过，且温度高，加热时间长，易使绿原酸氧化分解。水回流提取法的不足之处在于提取温度比醇提法更高，滤过分离困难，绿原酸含量也比醇提法偏低。超声纤维素酶法与乙醇超声提取法比较，更节省能源，更适合工业化生产。

超声纤维素酶法提取可从多方面促进绿原酸的提取，首先运用纤维素酶破坏细胞壁中的纤维素[9]，以加快杜仲叶有效成分的释放，利于提取分离。其次，利用超声波的机械效应、空化效应及热效应，通过增大介质分子的运动速度，可增大介质的穿透力以提取中药有效成分。综上，笔者优选的工艺不但可提高绿原酸提取率，更重要的是大大节约了能源，由于所用的酶安全、廉价，同时工艺还具有经济、环保等特点，为杜仲叶绿原酸的工业化提取奠定了试验基础。

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[5]王柏强，刘福，江承平，等.正交试验优化杜仲叶中绿原酸的超声提取工艺[J].中国药业，2013，22（23）：43.

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