丹墨胶囊对泼尼松在大鼠体内药动学的影响Δ

韦炳华，唐 蕾，杨 倩，李瑞明，任 斌（中山大学附属第一医院，广州 510080）

丹墨胶囊是中山大学附属第一医院肾脏病研究所叶任高教授40余年治疗肾炎的中药经验方制成的院内制剂，对慢性肾炎、隐匿性肾炎、以肾虚为主的肾病综合征治疗效果显著；糖皮质激素是治疗肾病综合征、肾小球肾炎和狼疮性肾炎等的主要药物。临床报道[1-4]丹墨胶囊与糖皮质激素合用治疗肾脏疾病，能明显提高糖皮质激素的治疗效果，减少激素的使用量，并减少激素的不良反应。但是，丹墨胶囊对激素产生影响的机制尚不明确。为此，笔者考察了丹墨胶囊对泼尼松在大鼠体内药动学的影响，探讨可能发生的药动学相互作用，以为临床两药合用提供实验依据。

1 材料

1.1 仪器

1515型高效液相色谱仪，包括600型低压梯度泵、717型自动进样器、2489型紫外检测器、Millennium32色谱工作站（美国Waters公司）；XW-80A型旋涡混合器（上海医科大学仪器厂）；3K18型高速冷冻离心机（美国Sigma公司）；AG-45型电子天平（瑞典Mettler Toledo公司）；Milli-Q型超纯水装置（美国Millipore公司）。

1.2 药品与试剂

丹墨胶囊（中山大学附属第一医院制剂室，批号：101003，规格：0.4 g/粒）；醋酸泼尼松（广东华南药业集团有限公司，批号：110205，规格：5 mg/片）；羧甲基纤维素钠（美国Sigma-Aldrich公司，批号：MKAA1662）；泼尼松、泼尼松龙、地塞米松对照品（美国Sigma公司，批号分别为200-020-5、200-021-7、200-003-9，纯度分别为98%、98%、95%）；乙腈、甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

1.3 动物

清洁级SD大鼠12只，♂，体质量220～310 g，由广东省实验动物中心提供[实验动物使用许可证号：SCXK（粤）2008-0002]。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：CC 250/4.6 Nucleodur 100-5C18（250 mm×4.6 mm，5 µm）；流动相：甲醇-水（A，含0.2%H3PO4，55∶45，V/V）-乙腈（B），梯度洗脱（0～15 min，100%A；＞15～18 min，100%A→20%A；＞18～23 min，20%A；＞23～28 min，20%A→100%A；＞28～30 min，100%A）；检测波长：240 nm；柱温：40 ℃；流速：1.0 ml/min；进样量：10 µl。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 取泼尼松和泼尼松龙对照品各10.0 mg，精密称定，置50 ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，得200 μg/ml的混合对照品工作液，再按梯度稀释至100、50、20、10、5、2、1、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01 μg/ml系列质量浓度，得混合对照品溶液，于4℃贮藏，备用。

2.2.2 内标溶液的制备 取地塞米松对照品10.0 mg，精密称定，置50 ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，得200 μg/ml的内标工作液，再稀释成500 ng/ml质量浓度，得内标溶液，于4℃贮藏，备用。

2.2.3 质控样品的制备 分别吸取不同质量浓度的混合对照品溶液10 μl，置1.5 ml塑料离心管中，N2吹干。加入空白血浆100 μl，涡旋30 s，制备质量浓度为4 500、250、15 ng/ml的质控样品（即高、中、低质量浓度的质控样品）。

2.3 血浆样品预处理

取待测大鼠血浆100µl，置塑料离心管（1.5 ml）中，加入0.1 mol/L NaOH溶液20 μl，涡旋混合1 min，再加入600 μl乙酸乙酯，混匀，涡旋振荡1 min，以离心半径为13 cm、10 800 r/min离心10 min，精密移取上清液于另一干净1.5 ml离心管中，N2吹干，残渣用20 μl纯乙腈复溶，涡旋1 min，以离心半径为13 cm、10 800 r/min离心5 min，进样测定。

2.4 方法学考察

2.4.1 方法专属性 分别取0.2 ml空白血浆、0.2 ml空白血浆+分析物对照品+内标、0.2 ml给药后大鼠血浆样品，按“2.3”项下方法处理样品，按“2.1”项下色谱条件进样测定。结果表明，在本实验条件下，泼尼松和泼尼松龙与内标地塞米松能完全分离，没有明显的内生杂质峰干扰。泼尼松和泼尼松龙与内标地塞米松的保留时间分别为8.7、11.3、16.2 min。色谱见图1。

2.4.2 标准曲线的制备 按“2.2.1”项下方法制备混合对照品系列溶液，按“2.3”项下方法处理，按“2.1”项下色谱条件进样测定。以各对应指标成分的质量浓度（x）为横坐标，峰面积和内标峰面积比值（y）为纵坐标，进行线性回归，得泼尼松、泼尼松龙回归方程分别为y＝2.092x－0.042 6（r＝0.999 8）、y＝1.730 9x+0.005 5（r＝0.999 5）。结果表明，泼尼松和泼尼松龙质量浓度均在10～5 000 ng/ml范围内与其峰面积和内标峰面积比值呈良好线性关系。

图1 高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms

2.4.3 精密度试验 按“2.2.1”项下方法制备高、中、低质量浓度的质控样品各5份，按“2.3”项下方法处理，按“2.1”项下色谱条件测定日内精密度（5次）、日间精密度（5 d）。结果，高、中、低质量浓度质控样品的日内、日间精密度RSD≤8.71%。精密度试验结果见表1。

表1 精密度和方法回收率试验结果（n＝5）Tab 1 Results of I precision and recovery test（sn＝5）

2.4.4 方法回收率试验 按“2.2”项下方法制备高、中、低质量浓度的质控样品各5份，按“2.3”项下方法处理，按“2.1”项下色谱条件测定。目标分析物峰面积经标准曲线换算得质量浓度（c）。回收率（%）＝（c/对应已知质量浓度）×100%。于同日内测定5次和连续5 d测定，计算日内、日间精密度。结果，方法回收率为85.24%～99.95%。方法回收率试验结果见表1。

2.4.5 准确度试验 按“2.2”项下方法制备高、中、低质量浓度的质控样品各5份，按“2.3”项下方法处理，按“2.1”项下色谱条件测得实际浓度。结果，高、中、低质量浓度质控样品的准确度在98.1%～101.6%之间，符合生物样品的检测要求。

2.4.6 稳定性试验 取“2.2”项下高、中、低质量浓度的质控样品各5份，置于室温贮藏（25℃）4 h后测定，考察血浆样品的短期稳定性；取“2.3”项下高、中、低质量浓度的标准质控样品各5份，冷冻贮藏于－20℃，7 d后测定，考察血浆样品的长期稳定性；取“2.3”项下高、中、低质量浓度的质控样品各5份，贮藏于－20℃，在室温中充分解冻，然后再次冷冻，每次间隔24 h，重复3个冻融周期后测定，考察血浆样品的3周期冻融稳定性。结果显示，血浆样品在室温放置、冰冻保存、反复冻融的条件下均有很好的稳定性。稳定性试验结果见表2。

2.5 药动学研究

表2 稳定性试验结果（n＝5）Tab 2 Results of stability test（n＝5）

12只♂SD大鼠随机均分为两组，即单用丹墨胶囊组（864 mg/kg）与联合用药组（864 mg/kg丹墨胶囊+42 mg/kg醋酸泼尼松），ig给药，每天1次，连续14 d。采血前ig醋酸泼尼松混悬液（42 mg/kg），于0、0.083、0.16、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、8 h由大鼠右颈总静脉采血0.3 ml（每次采血后补充同样体积含50 u/ml肝素的生理盐水），置1.5 ml肝素化的塑料离心管中，4℃下以离心半径为13 cm、5 000 r/min离心5 min，分离吸取上层血浆，－20℃贮藏，待测；大鼠血浆样品经“2.3”项下方法处理后进样测定。结果采用WinNonlin4.2程序处理，用非房室模型估算药动学参数。浓度-时间曲线见图2、图3；药动学参数见表3、表4。

图2 大鼠体内泼尼松的浓度-时间曲线Fig 2 The plasma concentrations-time curves of prednisone in rats

图3 大鼠体内泼尼松龙的浓度-时间曲线Fig 3 The plasma concentrations-time curves of prednisolone in rats

表3 大鼠体内泼尼松的药动学参数（±s，n＝6）Tab 3 Pharmacokinetic parameters of prednisone in rats（±s，n＝6）

表3 大鼠体内泼尼松的药动学参数（±s，n＝6）Tab 3 Pharmacokinetic parameters of prednisone in rats（±s，n＝6）

与单用丹墨胶囊组比较：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.Danmo capsule group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

参数t1/2，h tmax，h cmax，ng/ml AUC0-2.5 h，ng·h/ml MRT0-2.5 h，h联合用药组1.18±0.24 0.25±0.17 64.37±9.82＊97.91±19.44＊＊1.02±0.07单用丹墨胶囊组0.91±0.37 0.50±0.25 156.91±12.59 257.26±33.58 1.04±0.14

表4 大鼠体内泼尼松龙的药动学参数（±s，n＝6）Tab 4 Pharmacokinetic parameters of prednisolone in rats（±s，n＝6）

表4 大鼠体内泼尼松龙的药动学参数（±s，n＝6）Tab 4 Pharmacokinetic parameters of prednisolone in rats（±s，n＝6）

与单用丹墨胶囊组比较：＊P＜0.05vs.Danmo capsule group：＊P＜0.05

参数t1/2，h tmax，h cmax，ng/ml AUC0-8 h，ng·h/ml MRT0-8 h，h单用丹墨胶囊组1.59±0.40 0.25±0.08 179.90±10.86 706.26±129.80 2.53±0.33联合用药组1.54±0.23 0.25±0.08 511.67±26.27＊824.38±175.44 1.49±0.45

3 讨论

糖皮质激素对肾脏疾病如肾病综合征、肾小球肾炎和狼疮性肾炎的治疗有非常重要的作用，常作为首选治疗药物，其代表药主要有泼尼松和甲基泼尼松龙。泼尼松极易在消化道吸收，其本身无生物活性，进入体内后经肝脏代谢转化为有活性的泼尼松龙从而发挥药理作用；泼尼松龙在肾脏代谢失活，转化为无活性的泼尼松排出体外。本研究表明，丹墨胶囊与醋酸泼尼松联合用药时，原药泼尼松cmax和AUC均明显减少，代谢产物泼尼松龙cmax明显升高。提示丹墨胶囊能加快泼尼松向泼尼松龙的转化，泼尼松转化成有活性代谢产物泼尼松龙的速度加快、药量增多，说明丹墨胶囊可提高泼尼松的吸收转化速度，使得血浆中泼尼松龙的cmax明显升高。实验证实，临床上两药合用，有利于提高泼尼松龙的药物质量浓度，增加激素疗效。

丹墨胶囊处方为丹参、墨旱莲、女贞子、益母草、生地黄、银花、茜草、地骨皮、全蝎。方中墨旱莲滋补肝肾、凉血止血，女贞子合用滋养肝肾之阴，为君药；丹参活血止血，生地黄清热凉血、养阴生津，两药辅助君药加强滋阴止血之效，为臣药；益母草活血祛瘀、利尿消肿，银花清热解毒、疏散风热，茜草清热凉血止血，地骨皮清退虚热，四药合用起佐助之力，为佐药；全蝎息风止痉，解毒通络，为使药。诸药合用，具滋肾养阴、清热凉血止血之功效。糖皮质激素的代谢主要是与CYP3A、糖蛋白（P-gp）转运体和11β-HSD有关，其中11β-HSD是其最重要的代谢酶。有研究证实[5-9]，丹墨胶囊中的君药墨旱莲提取物可抑制CYP1、CYP2及CYP3A活性，抑制P-gp转运；还有文献报道[10-14]，墨旱莲中的黄酮类成分木樨草素、芹菜素可抑制20α-HSD活性，芹菜素可抑制3β-HSD2活性，芹菜素、香叶木素可抑制17β-HSD活性，槲皮素可抑制11β-HSD活性，而20α-HSD、3β-HSD2、17β-HSD和11β-HSD具同源性。丹墨胶囊增加泼尼松在血中转化成泼尼松龙的转化速度和药量，可能与其君药墨旱莲主要活性成分影响了激素代谢酶有关，这需要深入地研究墨旱莲众多药理作用的内在物质基础[15]，阐述其作用机制。

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