HPLC法同时测定人血浆中苦参4种生物碱的含量

李志红（解放军第324医院药剂科，重庆 400020）

苦参，别名苦骨、地槐等，为豆科植物豆参Sophorae flavescensAit的干燥根[1]。生长于海拔1，500米的地区，多生在山坡、沙地、草坡、灌木林中和田野附近，目前尚未由人工引种栽培。其具有清热燥湿、杀虫、利尿之功效，中医临床常用于治疗热痢、便血、黄疸尿闭、赤白带下、阴肿阴痒、湿疹等。现代药理研究表明，苦参具有调节血脂和抗脂质氧化[2-3]，抗肿瘤[4]，抗肝纤维化[5]，抗炎[6]，抗病毒[7]，及免疫调节作用[8]。苦参中多种生物碱是其主要的药效学成分，其中以槐定碱、槐果碱、苦参碱、氧化苦参碱较为重要（见图1）。目前，对人血浆中苦参碱检测多集中于2种或单种成分[9-10]，未见4种成分同时测定的报道。为此，笔者建立了在人血浆中同时测定槐定碱、槐果碱、苦参碱、氧化苦参碱的高效液相色谱（HPLC）测定法，以为苦参碱体内药动学的研究提供支持。

图1 4种生物碱化学结构式Fig 1 The chemic structureof 4 kinds of alkaloids

1 材料

1.1 仪器

1100型高效液相色谱仪，包括Agilent chemstation色谱工作站、1100DAD型检测器（美国Agilent公司）；BSA223S型电子天平（德国赛多利斯公司）；TG18G型高速离心机（湖南凯达科学仪器有限公司）。

1.2 试剂

槐定碱、槐果碱、苦参碱、氧化苦参碱对照品（中国食品药品检定研究院，批号分别为1105-200005、1201-2014、1085-9702、1127-7802）；十二烷基硫酸钠、乙腈为色谱纯，水为三蒸水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX NH2（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-无水乙醇-3%磷酸溶液（81∶10∶9，V/V/V）；流速：1 ml/min；检测波长：210 nm；柱温：室温；进样量：20 μl。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 分别精密称取经五氧化二磷减压干燥至恒质量的槐定碱、槐果碱、苦参碱、氧化苦参碱对照品适量，用乙腈-无水乙醇（80∶20，V/V）溶解，分别制备成质量浓度分别为0.469 8 mg/ml、0.503 5 mg/ml、0.436 0 mg/ml、0.497 5 mg/ml的对照品母液。精密移取槐定碱对照品溶液3 ml，槐果碱对照品溶液1 ml、苦参碱对照品溶液2 ml、氧化苦参碱对照品溶液5 ml，置100 ml量瓶中，用乙腈-无水乙醇（80∶20，V/V）溶解并定容至刻度，制备成混合对照品溶液，4℃贮藏，备用。精密移取混合对照品溶液10 ml，置20 ml量瓶中，用乙腈-无水乙醇（80∶20，V/V）定容至刻度，混匀，即为混合对照品系列溶液①。再分别精密移取混合对照品系列液①10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 25 ml，置10 ml量瓶中，用乙腈-无水乙醇（80∶20，V/V）定容至刻度，分别混匀，得混合对照品系列溶液②～⑧，4℃贮藏，备用。

2.2.2 质控样品的制备 分别取不同质量浓度的混合对照品系列溶液10 μl，置50 μl空白血浆中，得高、中、低质量浓度的质控样品，即槐定碱（1 409.40、352.35、88.09 ng/ml）、槐果碱（503.50、125.88、31.47 ng/ml）、苦参碱（872.00、218.00、54.50 ng/ml）、氧化苦参碱（2 487.50、621.88、155.45 ng/ml）。－20 ℃贮藏，备用。

2.3 血浆样品的处理

取人血浆100 μl，置10 ml试管中，依次加入混合对照品溶液100 μl，氯仿3 ml，涡旋3 min，以离心半径为13.5 cm、6 000 r/min离心5 min，取有机相于另一试管中，40℃下氮气吹干，残渣以乙腈-无水乙醇（80∶20，V/V）溶解，以离心半径为13.5 cm、12 000 r/min离心5 min，取上清液20 μl进样测定。

2.4 方法学考察

2.4.1 方法专属性 取“2.2.2”项下中质量浓度的质控样品溶液适量，按“2.3”项下方法处理，按“2.1”项下色谱条件进样测定。结果表明，血浆中所含的内源性物质不干扰被测物和内标的测定，且二者峰形良好。色谱见图2。

图2 高效液相色谱图Fig 2 HPLC chromatograms

2.4.2 标准曲线的制备 按“2.2.1”项下方法制备混合对照品系列溶液②～⑧，按“2.3”项下方法处理，按“2.1”项下色谱条件进样测定。以各对应指标成分的质量浓度（x）为横坐标，待测物峰面积积分值（y）为纵坐标，进行线性回归。得槐定碱、槐果碱、苦参碱、氧化苦参碱回归方程分别为y＝375 412x－45 844（r＝0.9996）、y＝623 857x－6 425（r＝0.999 8）、y＝403 528x－13 792（0.999 5）、y＝400 769x－36 308（r＝0.999 3）。结果表明，槐定碱、槐果碱、苦参碱、氧化苦参碱进样量分别在0.034 72～0.258 60、0.012 84～0.113 65、0.023 77～0.240 93、0.452 48～4.520 63 μg范围内与待测物峰面积积分值呈良好线性关系。

2.4.3 精密度试验 按“2.2.2”项下方法制备高、中、低质量浓度的质控样品各6份，按“2.3”项下方法处理，按“2.1”项下色谱条件测定日内精密度（6次）、日间精密度（5 d）。结果，高、中、低质量浓度的质控样品日内、日间精密度的RSD均小于2.0%，表明本试验方法符合目前生物样品分析方法指导原则中的有关规定。

2.4.4 稳定性试验 取“2.4.3”项下高、中、低质量浓度的标准质控样品各5份，置于室温保存（25℃）24 h后测定，考察血浆样品的短期稳定性；取“2.4.3”项下高、中、低质量浓度的标准质控样品各5份，冷冻贮藏于－20℃，30 d后测定，考察血浆样品的长期稳定性；取“2.3”项下高、中、低质量浓度的标准质控样品各5份，冷冻贮藏于－20℃，在室温中充分解冻，然后再次冷冻，每次间隔24 h，重复3个冻融周期后测定，考察血浆样品的3周期冻融稳定性。结果，被测物在上述贮藏条件下测得实际值均在理论值的90.36%～104.16%范围波动，RSD＜3.2%，表明4种成分在血浆样品中稳定性良好。

2.4.5 重复性试验 取“2.4.3”项下高、中、低质量浓度的标准质控样品各5份，按“2.1”项下色谱条件测定。结果，槐定碱、槐果碱、苦参碱、氧化苦参碱峰面积的RSD分别为2.8%、2.6%、1.7%、2.3%，表明本方法重复性较好。

2.4.6 提取回收率试验 取“2.4.3”项下高、中、低质量浓度的标准质控样品适量，按“2.1”项下色谱条件测定，得4种样品的峰面积。取空白血浆适量，按“2.3”项下方法离心得上清后加入槐定碱、槐果碱、苦参碱、氧化苦参碱对照品，以“2.1”项下色谱条件进行测定，得4种峰面积，以前后峰面积比值为槐定碱、槐果碱、苦参碱、氧化苦参碱的提取回收率。提取回收率试验结果见表1。

表1 提取回收率试验结果Tab 1 Result of extraction recovery experiments

3 讨论

槐定碱、槐果碱、苦参碱、氧化苦参碱都是喹喏里西啶生物碱，笔者采用Agilent ZORBAX NH2（150 mm×4.6 mm，5 μm），测定4种生物碱，发现色谱条件中流动相的pH及磷酸溶液的酸度、用量对4种喹喏里西啶生物碱的分离影响较大。因此，笔者试用了各种配比的乙腈-无水乙醇-磷酸溶液，确定了用乙腈-无水乙醇-3%磷酸溶液（81∶10∶9，V/V/V）可实现4种生物碱基线分离。虽然利用无机盐缓冲溶液也可以达到基线分离的目的，但是考虑到无机盐缓冲溶液可能影响色谱柱的寿命，最终仍采用乙腈-无水乙醇-3%磷酸溶液来进行分离。

2010年版《中华人民共和国药典》（一部）苦参检测项下采用波长220 nm测定苦参碱。本研究中发现，210 nm波长处4种生物碱的吸收峰均比220 nm处更大，更易测定，且不受末端吸收的影响，故采用210 nm为测定波长。

综上所述，本研究采用HPLC法测定人血浆中槐定碱、槐果碱、苦参碱、氧化苦参碱，方法灵敏度高、精密度好，可用于苦参4种生物碱的药动学研究。

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