透明质酸钠微球制备工艺的研究

李丹，初阳（1.沈阳医学院奉天医院药学部，沈阳11004；.中国医科大学附属第一医院药学部，沈阳11004）

透明质酸（Hyaluronic acid，HA）及其钠盐是广泛存在于人体及动物体内的一种黏多糖，是体内重要的生理活性物质，广泛应用于食品、日化和医药领域[1-2]；其在组织形成、细胞调控及血管生成方面都起着重要的作用[3]。HA本身具有良好的生物相容性、高黏弹性和毒副作用小等优点，既可延缓皮肤衰老，补充皮肤水分；又可促进伤口愈合，防止疤痕产生[4-5]。虽然已有上市的含HA的化妆品[6]，但其仅作为保湿剂出现，并非作为主要成分使用，因此药用效果不明显，也不适合大规模药用。

本文以透明质酸钠为模型药物，海藻酸钠为骨架材料，采用乳化-交联法制备了包载透明质酸钠的海藻酸钠微球。该制剂处方选择和制备工艺的关键是利用微球所形成的不溶性骨架，以降低透明质酸钠的释放速度，延长释药时间，从而达到提高生物利用度的目的。本研究可为进一步制备透明质酸钠缓释制剂奠定基础。

1 材料

DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市英峪予华仪器厂）；FA1104电子天平（上海民桥精密科学仪器有限公司）；UV-9100型紫外分光光度计（北京瑞利分析仪器有限公司）；DMBA450生物数码显微镜（麦克迪实业集团有限公司）；LS320激光粒度仪（美国Beckman公司）。

三乙醇胺（天津市博迪化工有限公司）；透明质酸钠（山东福瑞达生物医药有限公司，批号：0911062，药用级，含量：99.5%）；海藻酸钠（河北大唐生物工程有限公司，药用级）；海藻酸钠微球（沈阳医学院奉天医院药学部）；对羟基苯甲酸乙酯、氯化钙、聚山梨酯80均为药用级；二氯甲烷、异丙醇、液体石蜡、丙三醇、硬脂酸、白凡士林、阿利新蓝均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 透明质酸钠含量测定方法的建立

精密称量透明质酸钠，用去离子水溶解后配成质量浓度为53.15、106.3、212.6、318.9、425.2 mg/L的标准溶液，摇匀。取上述标准溶液各1 ml，加入10 ml量瓶中，加6 ml阿利新蓝染料染色，混合后用去离子水稀释至刻度，作为显色溶液。在510 nm波长处测定各溶液的吸光度值。以透明质酸钠质量浓度（ρ）为横坐标，标准溶液与显色溶液的吸光度差值（A）为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程为：A＝0.0017ρ+0.1848（r＝0.9980，n＝5）。结果表明，透明质酸钠检测质量浓度线性范围为53.15～425.2 mg/L。低、中、高3个质量浓度（53.15、212.6、425.2 mg/L）的标准溶液的日内精密度RSD分别为1.88%、0.80%、0.63%（n＝5）；日间精密度RSD分别为2.57%、1.05%、0.84%（n＝5）；平均回收率为（97.9±1.80）%，RSD＝1.84%（n＝3）。

2.2 透明质酸钠微球的制备

称取适量透明质酸钠，精密称定，溶入蒸馏水中，超声溶解后，将适量海藻酸钠细粉溶于其中配成一定浓度的海藻酸钠溶液，静置除去气泡，后用医用9号注射器缓缓滴入搅拌的混合油相中。以一定的分散转速磁力搅拌分散一定时间后，加入适量用氯化钙饱和的交联剂，固化[7]。将制得的微球分别用异丙醇洗涤2～3次，抽滤后，40℃干燥6 h，密封贮藏备用。

2.3 透明质酸钠包封率及载药量的测定

取制备的海藻酸钠微球50 mg，置于蒸馏水5 ml中超声10 min；37℃放置24 h，取上清液置于10 ml量瓶中，研磨微球至其破碎，离心15 min，将上清液吸取于量瓶中，用蒸馏水稀释定容至10 ml；用0.45 μm微孔滤膜滤过。测定上清液中的药物含量，计算微球中药物的包封率及载药量：包封率＝微球中包裹的透明质酸钠质量/透明质酸钠加入量×100%；载药量＝微球中包裹的透明质酸钠质量/微球的质量×100%。

2.4 处方因素的考察

经过多次预试验，确定对包封率影响较大的几个处方因素，考察结果如下。

2.4.1 海藻酸钠质量分数。固定其他的因素，考察海藻酸钠的质量分数。分别配成含有1%透明质酸钠的1%、2%、3%海藻酸钠溶液，滴入二氯甲烷与植物油等比例组成的混合油相中，以300 r/min转速分散15 min，加入交联剂90 min后制备海藻酸钠微球，其水相与交联剂体积比为1∶1，透明质酸钠与海澡酸钠质量比为1∶2。结果显示，当海藻酸钠质量分数为1%时，黏度较低，无法成球；当海藻酸钠质量分数为2%时，可成球，且干燥后球之间无粘连，镜下观察微球形态较好，包封率为（45.17±6.12）%（n＝3）；当海藻酸钠质量分数为3%时，虽然包封率较高（57.28±5.54）%（n＝3），但由于黏度较大，微球形态不佳。因此，选择海藻酸钠质量分数为2%。

2.4.2 混合油相比例。固定海藻酸钠质量分数为2%，制备方法同“2.4.1”项，选择植物油与二氯甲烷的混合油相，体积比为3∶1、2∶2、1∶3，并加入2%油酸山梨坦作为油相的表面活性剂，制备海藻酸钠微球。结果显示，当体积比为3∶1和2∶2时，混合油相黏度大，干燥后微球粘连严重，微球形态不佳，包封率分别为（38.94±8.46）%（n＝3）和（37.25±8.14）%（n＝3）。因此，选择体积比为1∶3，此时包封率为（45.17±6.12）%（n＝3）。

2.4.3 交联剂加入体积。以2%海藻酸钠溶液作为内水相，植物油与二氯甲烷体积比为1∶3的混合油为油相，令水相与加入交联剂的体积比为2∶1、1∶1、1∶2，按“2.4.1”项下方法制备海藻酸钠微球。结果包封率依次为（38.97±4.43）%、（45.17±6.12）%和（43.86±7.35）%（n＝3），表明当体积比超过1∶1后，再提高交联剂的量，微球的包封率基本不再变化，粒径减小不明显。因此，选择水相与交联剂体积比为1∶1。

2.4.4 透明质酸钠与海藻酸钠质量比。分别配制透明质酸钠与海藻酸钠质量比为1∶4、1∶2、1∶1的溶液为水相，水相与交联剂的体积比为1∶1，按“2.4.3”项下方法制备海藻酸钠微球。结果包封率依次为（48.93±8.69）%、（45.17±6.12）%和（31.96±7.54）%（n＝3），载药量依次为（6.99±1.64）%、（11.29±2.16）%和（12.78±2.71）%（n＝3），表明透明质酸钠与海藻酸钠比例增加，微球载药量增加，包封率明显降低。因此，综合考虑，选择质量比为1∶2。

2.5 工艺因素的考察

经过多次预试验，确定了对包封率影响较大的几个工艺因素，考察结果如下。

2.5.1 分散时间。以2%海藻酸钠溶液为水相,透明质酸钠与海藻酸钠质量比为1∶2，含2%油酸山梨坦、混合油相比例为1∶3的混合油为油相，水相与交联剂体积比为1∶1，以300 r/min转速分散5、15、30 min，加入交联剂90 min后制备海藻酸钠微球，制备方法同“2.2”项。结果包封率分别为（37.4±4.37）%、（45.17±6.12）%和（46.26±8.49）%（n＝3），表明随着时间增加，包封率增加，但时间过长会使微球粘连。因此，选择分散时间为15 min。

2.5.2 分散转速。固定分散时间为15 min，分别在100、300、500 r/min下按“2.4.1”项下方法制备海藻酸钠微球。结果包封率分别为（56.48±8.96）%、（45.17±6.12）%和（34.32±7.34）%（n＝3），表明随转速增加，包封率下降，但转速过低微球粒径大，分布不均。因此，选择分散转速为300 r/min。

2.5.3 交联时间。固定分散转速为300 r/min，交联时间分别为30、90、150 min下按“2.2”项下方法制备海藻酸钠微球。结果包封率分别为（31.76±3.62）%、（45.17±6.12）%和（47.03±5.73）%（n＝3），表明随着交联时间延长，包封率增加，但增加到90 min后，再延长交联时间，包封率提高不明显，且微球有粘连现象。因此，交联时间选择90 min。

2.6 包载透明质酸钠的海藻酸钠微球处方的优化

根据单因素考察结果，选取透明质酸钠质量分数、透明质酸钠与海藻酸钠质量比、交联时间和分散转速为因素进行正交试验，以包封率为指标对处方进行优化，筛选出包封率高、形态好的微球最优处方。影响因素及因素水平取值见表1，正交试验设计及试验结果见表2，极差分析见表3，方差分析见表4。

表1 影响因素及因素水平取值Tab 1 Factors and levels

表2 正交试验设计及试验结果Tab 2 Orthogonal design and results

表3 正交试验结果极差分析Tab 3 Results of analysis of range

表4 正交试验结果方差分析Tab 4 Results of analysis of variance

由表2可见，各因素对指标的影响程度顺序为C＞A＞B＞D，最佳水平为A2B1C2D1，即海藻酸钠质量分数为2%，透明质酸钠与海藻酸钠质量比为1∶3，交联时间为90 min，分散转速为200 r/min。

由表3可见，交联时间对微球的包封率有显著影响，而海藻酸钠质量分数、透明质酸钠与海藻酸钠质量比及分散转速对包封率影响不明显。

2.7 验证试验

按最优处方制备3批微球，其形态圆整、粒径分布均匀，测得包封率为（58.92±3.06）%，载药量为（10.96±1.12）%；将微球分散于水中，滴入激光粒度测定仪，测得微球平均粒径为（107.8±5.51）µm。

3 讨论

氯化钙的水溶液相当于水相，其在油相中也以液滴形式被分散，因此与海藻酸钠液滴接触几率很小，且液滴各点交联不均，交联效果不佳。用氯化钙饱和的二氯甲烷可与油互溶，加入后，可以在海藻酸钠液滴周围形成均匀的交联剂浓度，即液滴各点交联均匀。故本文选择氯化钙溶液饱和的二氯甲烷为交联剂。

一次性加入交联剂，只是在最初形成交联剂的浓度梯度，随着交联剂的消耗，浓度梯度降低，交联效果会变差，内层交联不完全，所以包封率较低，粒径稍大，但形态较好。分次加入交联剂可以在不同时间点始终保持着浓度梯度，交联效果好，交联程度深，包封率高，粒径小，形态好。

分散转速显著影响微球粒径及形态。当分散转速为100 r/min时，提供的外力不足以降低水相的粒径，使得微球大小不一；但由于转速低，水相中药物渗漏量小，包封率较高。当转速为500 r/min时，粒径虽小，但包封率降低，体系黏度增加，出现粘连现象。

因本文中剂型为中间剂型，最终剂型为乳膏剂，故对粒径考虑不多，仅是在验证试验时测量了粒径，试验时也只是在显微镜下观察了微球的形态，未照电镜。

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