HPLC法测定奥拉西坦原料药中的有关物质

刘宪勇，刘世军，孙克明，张 敏，毕文超，王 岩（武警山东总队医院药剂科，济南 250014）

奥拉西坦是由意大利ISF公司于1974年首先合成的吡咯烷酮类衍生物，为新一代脑代谢改善药，其口服制剂和注射制剂分别于1987年和1990年在意大利首次上市。本品适用于轻中度血管性痴呆、老年性痴呆以及脑外伤等引起的记忆与智能障碍[1-3]，其不良反应少[4]、耐受性好[5]。国家食品药品监督管理局试行标准中的奥拉西坦原料药有关物质检查分别采用的是以色谱柱为氰基柱和C8的高效液相色谱（HPLC）法[6-7]，另有文献报道采用色谱柱为多聚物柱[8]、氨基柱的HPLC法。由于奥拉西坦合成工艺不同所引入的杂质如合成原料[甘氨酰胺盐酸盐和4-氯乙酰乙酸乙酯（CEA）]、中间体（4-氯-3-羟基丁酸乙酯）、副产物等不同，因此为控制按本文中合成路线合成的奥拉西坦原料药的质量，笔者参考奥拉西坦含量及有关物质检查方法[9-12]建立了色谱柱为C18、流动相为0.01 mol/L磷酸二氢钾溶液（用磷酸调节pH至3.0）等的HPLC法。结果表明，建立的色谱分析方法能够检出更多的杂质，且该色谱柱成本低。因此，最终确定本试验建立的HPLC法作为测定奥拉西坦原料药中有关物质的限量检查方法。

奥拉西坦的合成路线见图1。

图1 奥拉西坦的合成路线图Fig 1 Synthesis route of oxiracetam

1 材料

1.1 仪器

日立L-7100型HPLC仪、L-7420紫外检测器（日本日立公司）；LC-20AT HPLC仪、SPD-M20A二极管阵列检测器（日本岛津公司）。

1.2 药品与试剂

甘氨酰胺盐酸盐（武汉银河化工有限公司，批号：08-220，化学纯）；CEA（青岛寒冰化工有限公司，批号：08-220，化学纯）；中间体（批号：Z100901）、奥拉西坦原料药粗品（批号：C100903）、奥拉西坦原料药精品（批号：110201、110301、110302，纯度：99.8%、99.9%、99.8%）均为本院自制；奥拉西坦对照品（中国食品药品检定研究院，批号：101032-200901，纯度：99.7%）。

2 色谱条件的选择

流动相Ⅰ：参考奥拉西坦试行标准[6]，以甲醇-水（2∶3）为流动相Ⅰ。

流动相Ⅱ：参考文献[12]，以0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液（用磷酸调节pH至3.0）为流动相Ⅱ。由于此流动相中缓冲盐的浓度较高，易造成色谱柱堵塞，因此不采用此流动相。

流动相Ⅲ：经大量试验筛选确定以0.01 mol/L磷酸二氢钾溶液（用磷酸调节pH至3.0）为流动相Ⅲ。

色谱柱：月旭XB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速：0.8 ml/min；检测波长：214 nm；柱温：室温；进样量：20 μl。

在流动相Ⅰ条件下，甘氨酰胺盐酸盐、奥拉西坦峰与中间体峰保留时间分别为2.115、3.130、4.445 min，奥拉西坦的色谱峰保留时间太小，不能有效检验出样品中的杂质。故选择在流动相Ⅲ条件下，进行方法学考察试验。

3 方法学考察

3.1 系统适用性试验

精密称取甘氨酰胺盐酸盐、CEA、中间体和奥拉西坦对照品适量，加流动相稀释成质量浓度分别约为30、5、10、10 μg/ml的溶液，作为分离度试验溶液。精密量取此溶液20 μl，注入色谱仪，记录色谱图，见图2。

由图2结果表明，奥拉西坦色谱峰与相邻杂质峰均能有效分离，采用该色谱条件，可有效检出奥拉西坦原料药中合成原料及中间品残留，故初步确定此色谱条件为有关物质检查的色谱条件。

图2 系统适用性试验色谱图1.甘氨酰胺；2.奥拉西坦；3.中间体；4.CEAFig 2 Chromatograms of system suitability test1.glycinamide；2.oxiracetam；3.intermediate；4.CEA

3.2 破坏试验

称取奥拉西坦原料药精品（批号：110201）约11 mg 6份，分别置于10 ml量瓶中，分别进行如下处理：（1）加流动相溶解；（2）加入1 mol/L的盐酸溶液2.0 ml，室温放置2 h，用1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH至中性；（3）加入0.5 mol/L氢氧化钠溶液0.2 ml，室温放置3 min，立即用0.5 mol/L盐酸溶液调节pH至中性；（4）加入30%双氧水2.0 ml，室温放置1 h（另取流动相同法操作，作为氧化破坏空白溶液）；（5）于沸水中加热8 h，冷却至室温；（6）置于4500 lx的光照条件下，照射48 h。上述各处理后溶液均加流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液分别作为破坏前溶液及酸、碱、氧化、高温、强光破坏后溶液。

分别精密量取上述溶液各20 μl，注入色谱仪，色谱见图3，各分离指标结果见表1[其中分离度指主峰与最近杂质峰的分离度，物料平衡结果＝（破坏后峰总面积×破坏前称样量）/（破坏前峰总面积×破坏称样量）]。

由图3和表1可见，本品经酸、碱、氧化、高温、强光破坏试验，破坏出的各杂质峰均能与主峰完全分离，主峰纯度良好，不包含其他色谱峰；物料平衡结果表示，破坏试验中破坏出的杂质都能有效检出，表明该色谱条件适用于本品有关物质检查。确定采用该色谱条件进行奥拉西坦原料药有关物质检查。

3.3 线性关系试验

称取奥拉西坦对照品10.14 mg置于100 ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取1 ml置于100 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备溶液。分别精密量取上述贮备溶液2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 ml置于10 ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，分别精密量取20 μl注入色谱仪，记录色谱图。以质量浓度（c，μg/ml）为横坐标，以峰面积（A）为纵坐标，用最小二乘法计算回归方程及相关系数，得线性方程：A＝29538c+134.4（r＝0.9997，n＝5）。结果表明，奥拉西坦检测质量浓度线性范围为0.2104～0.6312 μg/ml。

3.4 精密度试验

称取奥拉西坦对照品10.23 mg，置于10 ml量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为溶液a；精密量取此溶液1 ml置于100 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为溶液b。精密量取上述溶液各20 μl分别注入色谱仪，记录色谱图，每份溶液重复进样6次。结果，溶液a和溶液b峰面积的RSD分别为0.31%和0.12%（n＝6），表明精密度良好。

图3 破坏试验色谱图A.酸破坏后溶液；B.碱破坏后溶液；C.氧化破坏后溶液；D.高温破坏后溶液；E.强光破坏后溶液；F.破坏前溶液；1.奥拉西坦Fig 3 Chromatograms of destory testA.solution destroyed by acid；B.solution destroyed by base；C.solution destroyed by oxidation；D.solution destroyed by heat；E.solution destroyed by light；F.solution undestroyed；1.oxiracetam

表1 破坏试验各指标结果Tab 1 Evaluation results of destroy test

3.5 稳定性试验

取“4”项下供试品溶液（批号：110201）分别于0、2、4、6、8 h进样记录色谱图，计算主峰面积和杂质的RSD。结果，主峰峰面积的RSD＝0.67%、最大单个杂质峰面积的RSD＝2.28%、总杂质的RSD＝4.90%（n＝5）。表明测定溶液在放置过程中杂质不断增大，因此确定本品测定溶液配制后须立即进样。

3.6 定量限和检测限试验

取奥拉西坦对照品，精密称定，用流动相逐步稀释并取样检测，按信噪比约为3、10时分别得出奥拉西坦检测限、定量限为0.95、3.95 ng。

4 样品中有关物质测定

称取奥拉西坦精品适量，用流动相制成约1.0 mg/ml的溶液作为供试品溶液；精密量取供试品适量，用流动相逐步稀释成0.01 mg/ml的溶液，作为对照溶液。在上述确定的色谱条件下，分别精密量取上述溶液各20 μl，注入色谱仪，记录色谱图，用主成分自身对照法测定杂质含量。结果3批样品（批号：110201、110301、110302）的最大单个杂质量分别为0.02%、0.03%、0.03%，总杂质量分别为0.02%、0.03%、0.03%。

5 讨论

采用现有的奥拉西坦质量标准中的方法，检测到的杂质数量少，对合成的中间体和降解产物无法有效分离和检出。本文所建立的奥拉西坦有关物质检查方法（与标准方法的区别只是流动相和色谱柱）条件下，奥拉西坦出峰时间适中，流动相中缓冲盐浓度较小，有关物质测定中各杂质峰与奥拉西坦峰能有效分离；本文提到的合成工艺中可能引入的工艺杂质及破坏试验中的降解杂质不影响奥拉西坦杂质的测定。

综上所述，采用本色谱条件进行有关物质测定，方法准确、简便，专属性强，灵敏度高，能有效控制奥拉西坦原料药中的有关物质。

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