HPLC法测定人血浆中拉莫三嗪的浓度及其影响因素研究

宋霞，张建隆，邱雯（1.兰州大学第二医院药学部，兰州730030；.天水市第一人民医院药剂科，甘肃天水 741000）

癫痫是脑部神经元突发性异常放电，导致短暂的大脑功能障碍的一种常见的神经系统慢性发作性疾病。药物治疗是治疗癫痫的首选方法，对大约70%的癫痫患者治疗有效。但传统抗癫痫药（如丙戊酸钠、卡马西平、苯巴比妥、苯妥英钠、扑痫酮、乙琥胺）耐受性问题严重，不良反应较多，因而近十几年来已有不少新型抗癫痫药问世。拉莫三嗪（Lamotrigine，LTG）是一种新型抗癫痫药，是封闭电压应用依从性的钠离子高通道阻滞药，主要通过抑制神经元释放病理性谷氨酸递质而发挥抗癫痫（EP）作用，具有广泛的抗癫痫谱，对多种类型的发作均有效。由于LTG适用人群广、药动学个体差异大，有必要对LTG用药患者进行治疗药物监测，以促进LTG合理应用及个体化用药方案的调整。本文建立了HPLC法测定LTG血药浓度，并收集我院癫痫患者LTG治疗药物监测情况进行相关分析。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1100型HPLC仪，包括G1315 A型二元泵、G1315 B型二极管阵列检测器、G2170 AA型色谱工作站（美国安捷伦公司）；GENIUS电子天平（德国赛多利斯集团）；TGL-16 GB小型通用离心机（上海安亭科学仪器厂制造）。

1.2 药品与试剂

拉莫三嗪对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100775-200401）；内标：氯霉素对照品（上海申药股份有限公司，批号：941203）；卡马西平对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100142-199503）；苯妥英钠对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100210-200401）；苯巴比妥（PB）对照品（国家麻醉品实验室，批号：1222-9602）；地西泮对照品（国家麻醉品实验室，批号：1230-9601）；氯硝西泮对照品（中国食品药品检定研究院，批号：1227-9701）。对照品均为含量测定用。甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为纯化水。

1.3 资料来源

2012年7月－2013年6月在我院癫痫中心、神经内科、神经外科诊治并进行LTG治疗药物监测的患者320例次，收集患者性别、年龄、体质量、LTG维持剂量、末次服药时间、取血时间、合并用药的药物和剂量等信息。

2 方法与结果

2.1 HPLC含量测定方法的建立

2.1.1 色谱条件：色谱柱为Luna C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-磷酸盐缓冲液（0.02 mol/l磷酸二氢钾，1 mol/L氢氧化钠调节pH至6.0，30∶70，V/V）；流速为1.0 ml/min；进样量为20 μl；柱温为30℃；检测波长为306 nm。在该色谱条件下，拉莫三嗪与氯霉素的保留时间分别为7.48、11.73 min，色谱见图1。

图1 对照品高效液相色谱图1.拉莫三嗪；2.氯霉素Fig 1 HPLC chromatograms of standard control1.lamotrigine；2.chloramphenicol

2.1.2 标准溶液的配制：准确称取LTG对照品10.8 mg，置于10 ml量瓶中，用甲醇溶解并定容，得1.08 mg/ml LTG储备液。将LTG储备液用甲醇稀释，配制质量浓度分别为4.0、8.0、16.0、40.0、64.0、80.0、96.0、128.0、160.0μg/ml的 LTG 标准溶液，将储备液与标准溶液于4℃下保存。

2.1.3 内标溶液的配制：准确称取氯霉素对照品10.0mg，置100 ml量瓶中，用甲醇溶解并定容，得100 μg/ml的内标溶液，于4℃下保存。

2.1.4 血浆样品的处理及测定：精密吸取血浆样品200 μl，置1.5ml离心管中，加入甲醇25μl及内标溶液25μl，涡旋混匀30 s后加入300 μl甲醇沉淀，涡旋混匀1 min，以离心半径为8 cm、10000 r/min离心10 min，取上清液经0.22 μm滤膜过滤，取滤液20 μl进样。

2.1.5 专属性考察：取空白血浆200 μl，按“2.1.4”项下方法操作，取上清液20 μl进样分析，得到空白血浆色谱图2 A。将空白血浆和拉莫三嗪与氯霉素对照品混合，按“2.1.4”项下方法操作，取上清液20 μl进样分析，得到样品溶液色谱图2 B。如图2所示，在该色谱条件下，血浆中的内源性物质对拉莫三嗪的测定无影响。

2.1.6 线性关系考察：精密吸取空白血浆200μl共9份，置于1.5 ml离心管中，分别加入不同质量浓度的LTG标准溶液25 μl及内标溶液25 μl，涡旋混匀30 s，使LTG血药浓度分别相当于0.5、1.0、2.0、5.0、8.0、10.0、12.0、16.0、20.0μg/ml。分别加入甲醇300 μl沉淀，涡旋混匀1 min，以离心半径8 cm、10000 r/min离心10min，取上清液经0.22μm滤膜滤过，取滤液20μl进样测定，记录色谱。以LTG系列溶液的峰面积（As）和内标峰面积（Ai）之比（y）为纵坐标、LTG质量浓度（x）为横坐标进行线性回归，得回归方程：y＝0.1736 x+0.0147（r＝0.9995，n＝9）。结果表明，LTG血药浓度在0.5～20 μg/ml范围内线性关系良好。

2.1.7 回收率与精密度试验：分别于200μl空白血浆中加入低、中、高3种质量浓度的LTG标准溶液20 μl，涡旋混匀30 s，使血药浓度分别相当于1.0、10.0、20.0 μg/ml，按“2.1.4”项下方法处理并测定。以LTG血药浓度测得量与加入量之比计算方法回收率。以同日内测得的LTG浓度计算日内精密度，以1周内6次测定的LTG浓度计算日间精密度，详见表1。

表1 回收率与精密度试验结果（±s，n＝5）Tab 1Results of recovery and precision test（s±s ，n＝5）

表1 回收率与精密度试验结果（±s，n＝5）Tab 1Results of recovery and precision test（s±s ，n＝5）

加入量，μg/ml 1.010.020.0测得量，μg/ml 0.94399.657318.3626回收率，%94.39±1.5795.57±2.2291.81±2.11日内R SD，%1.662.301.15日间R SD，%2.162.422.34

2.1.8 重复性试验：按“2.1.4”项样品制备方法制备同浓度样品8份，按并依法测定LTG浓度。结果，样品中LTG平均含量的RSD为1.89%，表明该法重复性良好。

2.1.9 干扰性试验：取临床常用的抗癫痫药卡马西平、PB、苯妥英钠、地西泮、氯硝西泮对照品适量，分别配制10.0 μg/ml的供试溶液，同时将上述所有对照品溶液与拉莫三嗪混合，按“2.1.1”项下色谱条件进样。结果表明，卡马西平、PB、苯妥英钠、地西泮、氯硝西泮对拉莫三嗪的测定均不产生干扰。另外，丙戊酸（VPA）分子结构中缺乏特征的紫外光谱吸收，用高效液相色谱法不能直接测定，因此，在本试验条件下，VPA对拉莫三嗪的测定无影响。

2.2 LTG血药浓度相关结果分析

2.2.1 样品采集：测定稳态时LTG的血药谷浓度。患者于下一次服药前抽取全血2～3 ml，置于普通采血管中，以离心半径为8 cm、4000 r/min于室温离心10 min，于－20℃冰箱保存待测。

2.2.2 分组及统计方法：将搜集的320例病例，按照LTG单用及联用分为3组：单用LTG组、LTG+VPA组、LTG+PB组，依次定义为1、2、3组。结果采用SPSS软件进行统计分析。应用逐步回归分析法评价分析影响LTG血药浓度的各类因素；用相关分析论证LTG与VPA以及PB之间的相互作用。

2.2.3 人群分布特征：2012年7月－2013年6月我院LTG血药浓度监测患者总人数为320例。其中男性158例，女性162例，男女性别比例为0.98∶1；17～45岁患者中女性居多，1～16岁患者中男性所占比例大。从患者年龄看，1～16岁患者占52.5%，儿童为我院LTG血药浓度监测患者中所占比例最大的人群；17～45岁青壮年患者占35.31%，属于第二主体人群；46～75岁中老年患者所占比例最小，见表2。

表2 监测患者人群性别与年龄分布（例）Tab 2 Population sex and age distribution of monitored patients（case）

2.2.4 LTG血药浓度的影响因素：整理320例血浆样本中LTG的含量及其可能的相关因素：性别、年龄、体质量、LTG给药剂量（mg/kg）、治疗组类别（1组：LTG单药治疗组；2组：LTG+VPA联合治疗组；3组：LTG+PB联合治疗组）输入统计学软件以通过逐步回归分析法逐步剔除或筛选影响LTG血药浓度的因素（检验水平为0.05）。结果显示，LTG给药剂量、联用VPA、联用PB可显著影响LTG血药浓度（P＜0.05），性别、年龄、体质量则与其不存在显著性的相关关系（P＞0.05）（见表3）。将影响因素LTG给药剂量、联用VPA、联用PB分别设定为自变量x1、x2、x3，LTG血药浓度设为因变量y，得逐步回归方程为：y＝0.6417 x1+2.5698 x2－2.0482 x3－0.2078；经方差分析，P＜0.01。由此方程可知，LTG血药浓度与LTG给药剂量、VPA的影响呈正相关，与PB的影响呈负相关。即增大LTG给药剂量或加用VPA可提高LTG的血浆水平，加用PB则能降低其血浆水平。

2.2.5 联合应用其他抗癫痫药对LTG血药浓度的影响：各组一般资料及药物剂量与血药浓度比较见表4。2组VPA剂量范围为1.85～58.33mg/（kg·d）；3组PB剂量范围为1.19～5.29mg/（kg·d）。其中PB联合治疗组的拉莫三嗪血药浓度[（0.8±0.92）μg/ml]＜LTG单药治疗组[（3.02±2.55）μg/ml]＜VPA联合治疗组[（5.37±3.47）μg/ml]。应用方差分析法比较3组血药浓度，得到F值为0.0190，P＜0.01，表明各治疗组间拉莫三嗪的血药浓度存在着极显著的差异。

表3 影响LTG血药浓度的因素分析（n＝320）Tab 3 Analysis of influential factors of plasma concentration of LTG（n＝320）

表4 血浆样本中拉莫三嗪的血药浓度（±s，n＝320）Tab 4 Plasma concentrations of LTG in plasma samples（±s ，n＝320）

表4 血浆样本中拉莫三嗪的血药浓度（±s，n＝320）Tab 4 Plasma concentrations of LTG in plasma samples（±s ，n＝320）

组别1组2组3组例数14915813平均年龄，岁23.32±17.0819.73±15.957.85±5.27平均体质量，k g 47.1±18.1646.3±20.2123.81±10.98 LT G平均维持剂量，mg/（k g·d）3.27±1.973.03±1.653.66±2.06 LT G平均血药浓度，μg/ml 3.02±2.555.37±3.470.8±0.92

2.3 不同组别中药物因素与LTG血药浓度的相关性分析

2.3.1 LTG单药治疗组：LTG给药剂量与LTG血药浓度的相关性：采用Pearson相关分析，对LTG给药剂量与LTG血药浓度之间的相互关系进行分析。结果表明，r＝0.119，P＞0.01。散点图显示，LTG血药浓度随着剂量的增加有上升趋势，但无统计学意义，见图3。

图3 LTG给药剂量与LTG血药浓度的相关性散点图Fig 3 The scatter diagram of LTG dose and LTG plasma concentration

2.3.2 LTG与VPA联合治疗组：（1）LTG给药剂量与LTG血药浓度的相关性。对LTG给药剂量与LTG血药浓度之间的相互关系进行分析，结果r＝0.536，P＜0.01，表明LTG血药浓度与LTG给药剂量具有显著的正相关关系。散点图显示，LTG血药浓度随着LTG给药剂量的增加而增加，见图4。（2）VPA给药剂量与LTG血药浓度的相关性。对VPA给药剂量与LTG血药浓度之间的相互关系进行分析，结果r＝0.112，P＞0.01。散点图显示，LTG血药浓度随着VPA剂量的增加有上升趋势，无统计学意义，见图5。（3）VPA血药浓度与LTG血药浓度的相关性。对VPA血药浓度与LTG血药浓度之间的相互关系进行分析，结果r＝0.206，P＜0.01，表明LTG血药浓度与VPA血药浓度具有显著的正相关关系。散点图显示，LTG血药浓度随着丙戊酸血药浓度的上升而上升，见图6。

图4 LTG给药剂量与LTG血药浓度的相关性散点图Fig 4 The scatter diagram of LTG dose and LTG plasma concentration

图5 VPA给药剂量与LTG血药浓度的相关性散点图Fig 5 The scatter diagram of VPA dose and LTG plasma concentration

图6 VPA血药浓度与LTG血药浓度的相关性散点图Fig 6 The scatter diagram of VPA plasma concentration and LTG plasma concentration

2.3.3 LTG与PB联合治疗组：对LTG给药剂量与LTG血药浓度之间的相互关系进行分析，结果r＝0.320，P＞0.01。对PB给药剂量与LTG血药浓度之间的相互关系进行分析，结果r＝0.040，P＞0.01。两种结果差异均无统计学意义。由于此组别中进行苯巴比妥血药浓度测定的样本较少，故不便进行PB血药浓度与LTG浓度的Parson相关分析。

3 讨论[1-6]

3.1 影响LTG血药浓度的因素

LTG属于苯基三嗪类化合物，是一种新型抗癫痫药，具有弱的抗叶酸活性。鉴于其良好的抗癫痫作用，可用于各种癫痫的治疗，也可单用或联合添加使用。近年来，国外也有资料报道显示LTG单药治疗部分性发作为主的成人及儿童癫患者也有较好的效果[1-2]。

本文特选取320例采用LTG治疗的癫痫患者，通过逐步回归分析法依次剔除或筛选影响LTG血药浓度的因素，结果显示LTG给药剂量、联合应用VPA或PB对LTG血药浓度影响具有统计学意义（P＜0.05）。从作用大小来看，联合应用VPA对LTG血药浓度的影响最为明显，其次为LTG给药剂量。从作用性质来看，LTG血药浓度与LTG给药剂量、VPA的影响呈正相关，与PB的影响呈负相关，即增大LTG给药剂量或者联合应用VPA可提高LTG血浆水平，而加用PB则可降低LTG的血浆水平。基于此，LTG的临床治疗不能仅仅通过给药剂量而了解其血药浓度。为了更好地实现个体化给药，为患者制订安全、合理、有效的治疗方案，建立该药的血药浓度监测工作必不可少。此外，体质量对LTG血药浓度的影响在国外文献亦有报道，研究指出由于高体质量患者体内LTG的清除速率较慢因而血浆水平较高[3]。本文研究未出现此结果。

3.2 联合用药对LTG血药浓度的影响

VPA与LTG联合应用是目前临床治疗难治性癫痫的主要方法。在药效学方面，LTG可增强γ-氨基丁酸（GABA）能突触后作用，VPA抑制兴奋性氨基酸释放，共同使膜电位趋于稳定，两药抗癫痫机制互补。在药动学方面，90%的LTG主要通过与葡萄糖醛酸结合代谢，大约30%～50%的VPA也经葡萄糖醛酸结合代谢，VPA可竞争性抑制LTG与葡萄糖醛酸的结合，使LTG清除率下降，从而延长LTG的半衰期，提高LTG的血浆水平。Gidal BE等[4]在一项研究中发现，丙戊酸的血药浓度在治疗水平（50～120μg/ml）便显著抑制LTG的清除率，VPA浓度超过20 μg/ml时对LTG的口服清除率的抑制程度最大。Paraskevas GP等[5]研究表明VPA与LTG合用临床疗效显著，且血浆内谷氨酸含量明显降低，其效果优于LTG单药治疗。

LTG在与具有肝酶诱导作用的药物如PB、卡马西平、苯妥英钠合用时，其药动学可发生改变，半衰期缩短。临床上联合使用时，通常需要增加LTG的剂量[6]。本研究通过逐步回归分析发现联合应用其他抗癫痫药是影响LTG血药浓度的重要因素（P＜0.05）。LTG单药治疗组与2个联合用药组做F值检验，显示3组LTG血药浓度有显著差异（P＜0.01）。VPA治疗组的LTG平均血药浓度最高，LTG单药治疗组次之，PB治疗组最低，表明加用PB可显著降低LTG血药浓度，加用VPA则能显著升高其血药浓度。

[1]Fakhoury TA，Barry JJ，Mitchell Miller J，et al.Lamotrigine in patients with epilepsy and comorbid depressive symptoms[J].Epilepsy&Behavior，2007，10（2）：155.

[2]McKee JR，Sunder TR，FineSmith R，et al.Lamotrigine as adjunctive therapy in patients with refractory epilepsy and mental retardation[J].Epilepsy&Behavior，2003，4（5）：386.

[3]Gidal GE，Anderson GD，Rutecki PR，et al.Lack of an effect of valproate concentration on lamotrigine pharmacokinetics in developmentally disabled patients with epilepsy[J].Epilepsy Research，2000，42（1）：23.

[4]Gidal BE，Sheth R，Parnell J，et al.Evaluation of VPA dose and concentration effects on lamotrigine pharmacokinetics：implications for conversion to lamotrigine monotherapy[J].Epilepsy Research，2003，57（1）：85.

[5]Paraskevas GP，Triantafyllou NI，Kapaki E，et al.Add-on lamotrigine treatment and plasma glutamate levels in epilepsy：relation to treatment response[J].Epilepsy Research，2006，70（2/3）：184.

[6]包军，何英，苏渊，等.影响拉莫三嗪稳态血药浓度的相关因素研究[J].中华儿科杂志，2001，39（8）：457.