猪胸导管内皮细胞的体外培养及其超微结构

张大伟 吕恒娟 刘贵波 李明秋 (牡丹江医学院，黑龙江 牡丹江 570)

随着人们对肿瘤淋巴道转移的研究不断深入，关于淋巴管内皮细胞(LECs)的形态学特征、生理功能、生物特性及其在病理过程的作用也逐渐成为研究热点。1984年Jottstcm和Walker首次成功地分离、培养了牛肠系膜LECs，并观察了其形态学特征〔1〕。近年来，随着分子生物学和细胞培养技术的飞速发展，许多学者成功地进行了多种组织的 LECs离体培养〔2～6〕。本研究从原代培养猪胸导来源的内皮细胞入手，研究LECs的形态学特性，并创建了可靠的培养方法，将为今后进一步研究LECs的功能和在肿瘤转移中的作用机制提供可靠的材料。

1 材料和方法

1.1 材料 取猪胸主动脉及其后面的组织(其内含胸异管)，用含有双抗(含青霉素链霉素各200 U/ml)和两性霉素 B 50 U/ml预冷的D-Hanks冲洗3次，尽可能去除血液和杂质，然后放入装有含双抗的D-Hanks液瓶中，置于冰袋预冷的保温箱内送实验室，立即进行试验。

1.2 LECs的分离纯化培养及传代 将胸导管两端游离，并插入导管，用止血钳将近心端导管结扎，在远心端向胸导管内注入胶原酶(1 g/L)，至胸导管充盈为止。将其置于37℃的恒温箱内消化10～15 min，用培养液加压冲洗管腔，将消化液和冲洗液离心(1 000 r/min，10 min)，吸去上清液，用培养液轻轻混悬细胞。将细胞接种于预先用明胶或多聚赖氨酸喷涂的培养皿中，然后置于37℃，体积分数为5%的CO2培养箱内培养。每隔2～3 d更换培养液1次。约10%细胞汇合生长形成单层。当内皮细胞生长形成单层时，进行1∶3传代培养。

1.3 免疫荧光染色鉴定LECs 原代LECs传代于24孔板中继续培养至60% ～80%，用预温磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，4%多聚甲醛室温固定60～90 min，PBS洗涤2次，0.5%Triton-100处理细胞30 min，PBS洗涤2次，山羊血清用PBS按1∶10的比例稀释后室温封闭20 min，后弃去多余液体，分别用鼠抗人血管皮生长因子受体(VEGR)-3(1∶200)，淋巴管内皮透明质酸受体-1(LYVE-1)(1∶400)抗体4℃孵育过夜，PBS洗涤3次，羊来源的二抗(1∶100)室温孵育30 min，PBS洗涤2次，链霉亲合素-生物素复合物(SABC)-异硫氰酸荧光素(FITC)(1∶100)室温孵育30 min，PBS洗涤4次，倒置荧光显微镜下观察拍照分析。

1.4 透射电镜观察LECs超微结构 收集培养的猪胸导管内皮细胞，离心后用3%戊二醛固定，1%锇酸固定，经脱水、浸透、包埋，制成半薄切片，然后制成超薄切片，透射电镜观察。

2 结果

2.1 细胞的原代培养及传代 原代细胞培养3～5 h后，大部分活力较高的内皮细胞完成贴壁;12～24 h后，内皮细胞已铺展形成由数个细胞组成的细胞群，每群细胞数目不等，形态呈梭形;培养18～24 h后，更换培养液继续培养。在2～3 d内，细胞生长缓慢，1 w后细胞分裂旺盛，进入对数生长期;10 d后，细胞呈生长密集状并汇合形成单层，呈特征性“鹅卵石状”或“铺路石状”镶嵌排列生长并有接触抑制现象，无重叠生长。当淋巴管内皮细胞形成单层时进行传代培养，25～30 min后，淋巴管内皮细胞开始贴壁生长，传代培养1 w后内皮细胞汇合形成单层。见图1。

图1 细胞原代培养(×100)

2.2 免疫荧光染色鉴定LECs 免疫荧光检测发现实验中所分离的细胞绝大部分均表达淋巴管内皮细胞标记分子LYVE-1和VEGFR-3。综合分析该细胞的纯度＞95%，淋巴管内皮细胞特征明确，可以用于后续实验。见图2。

2.3 LECs超微结构 在透射电镜下，内皮细胞呈卵圆形、短梭形、多角形或不规则形，从细胞膜上偶有一些长的突起。细胞核大，核仁清晰，细胞质内含有丰富的吞饮小泡，并有较多的线粒体和粗面内质网，在对数生长期可见双核仁。见图3。

图2 免疫荧光染色鉴定LECs

图3 透射电镜观察LECs超微结构

3 讨论

LECs在多次传代后性状会发生改变，因此在目前阶段认为原代培养LECs是比较可靠的实验方法，而LECs的长期培养建系长期以来都是一个难题。取材过程中传统方法是把胸导管完全游离，用镊子和眼科剪子仔细剥除胸导管表面的脂肪和纤维组织〔5～7〕，但在修剪胸导管过程中，常把胸导管小的属支剪断，使胸导管有一些漏点，以至于很难取到足够长的胸导管进行消化。

LECs活力有限，对培养条件要求较高。ECM是培养内皮细胞的专用培养基，其含有必需氨基酸、维生素和无机盐;ECGS能显著提高细胞的活力，缩短细胞的生长周期，未加入ECGS的培养基接种LECs后发现其扩增有限，难以生长。

目前 LECs的标记分子如 LYVE-1，VEGFR-3，Prox-1，Podoplanin等已经得到国内外学者的证实，其特异性均比较高〔8～11〕。本文采用两种标记分子对所培养的细胞进行免疫荧光细胞化学鉴定，排除所培养的细胞不是LECs的可能，尤其是在消化过程中可能造成污染的成纤维细胞和平滑肌细胞的干扰，同时也排除了生物学特性与LECs相近的微血管内皮细胞的可能。目前也有研究报道部分炎性细胞如肿瘤相关巨噬细胞，树突细胞也可表达LYVE-1〔12〕，但是此类细胞在本实验条件下难以生长。结果表明培养的LECs纯度比较高，达到95%可以用于进一步的实验。

透射电镜观察到，LECs胞质内有发达的线粒体和粗面内质网等细胞器，说明培养的淋巴管内皮功能较活跃。胞质中有丰富的吞饮小泡，这些小泡有运输物质的作用，这表明细胞有很强的吞饮能力。内皮细胞核淡染，以常染色质为主，核仁大而明显。在对数生长期细胞核内可见双核仁，这表明LECs具有旺盛的增殖分裂能力。此外，该细胞在体外培养至第3代时仍保持了内皮细胞的特性。

本实验改进了胶原酶灌注消化猪胸导管得到LECs的方法，可以用较少的材料获得数量和纯度均较高的LECs，成功率高，这为进一步研究LECs生理功能、免疫反应、生长发育提供有效的平台。此外，本实验还观察了LECs的超微结构，为进一步研究LECs提供了形态学依据。

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