白细胞介素18在非小细胞肺癌转移中的作用机制

李爱连 胡志芳 史宏恩 (西安医学院病原生物与免疫学教研室，陕西 西安 710021)

白细胞介素(IL)-18是一种常见的前炎症因子，在感染、癌症等各种疾病中发挥着重要作用〔1〕。IL-18通过增强自然杀伤细胞(NK)与T淋巴细胞的细胞毒性作用与增强干扰素(IFN)活性等作用发挥抗感染、抗肿瘤与增强免疫能力等生物学活性，且与自身免疫性疾病、肿瘤的发生与发展密切相关〔2〕。本文拟分析IL-18在非小细胞肺癌(NSCLC)转移中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 NSCLC高、低转移细胞由本科室常规培养。

1.2 试验仪器与试剂 DNA序列(上海博亚公司合成)，RNA提取、PCR扩增、逆转录试剂盒、pGEM-T载体、内切酶、连接酶均从Santa Cruz公司购入，RIPA缓冲液、Anti-IL-18小鼠单抗，Anti-actin小鼠多抗，显色试剂盒从Promega公司购入，G418、阳离子脂质体从Invitrogen公司购入。

1.3 检测方法

1.3.1 RT-PCR 提取NSCLC细胞总RNA，逆转录合成cDNA，以此为模板，使用β2-微球蛋白(β2-BMG)作为内参照，并按照PCR扩增试剂盒说明说进行PCR扩增，条件:变性94℃、30 s，退火 72℃、30 s，延伸 30 s，周期:28 个循环，最后一个周期延伸(72℃、7 min)，引物序列①IL-18:(正)5'-GCCGGTACCCGCATGGGTGGTGAACGACTAGAA-3';(反)5'-GCGTCTAGAGTCTTCGTTTTGAAACAGTGAA-3';②β2-BMG:(正)5'-GCTATCGGAAGAGCAGCGTACTCCAAAGA-3'(反)5'-AACCTGCTCSGATACATCAAACAT-3'。

1.3.2 Western印迹技术 采用RIPA缓冲液提取细胞总蛋白，采用β-actin作为试验组的内参对照，按照试剂盒说明书进行操作。

1.3.3 构建IL-18重组颗粒与细胞体外转移实验 在RT-PCR实验中，从NSCLC细胞株中扩增IL-18 cDNA，连接pGEM-T载体，内切酶鉴定并进行测序，成功构建IL-18重组颗粒。采用阳离子脂质体介导方法将IL-18真核表达质粒转染至NSCLC细胞株中，加入800 μg/μL的G418加压获取稳定的转染细胞。细胞体外转移实验:将稳定的转染细胞接种于培养液中，加入培养基，在血清条件下进行培养，培养条件:50 mg/L CO2、37℃中处理8 h，无水乙醇固定，高倍显微镜下检查视野中的穿膜细胞，重复进行3次实验，取平均值进。

1.4 统计学方法 应用SPSS18.0软件行t检验。

2 结果

2.1 IL-18在NSCLC高、低转移中的蛋白与 mRNA表达Western印迹检测结果表明:低转移细胞株未检测到IL-18蛋白表达，高转移的NSCLC细胞株的IL-18蛋白表达量高达3.98±2.01，两者比较差异显著(t=6.17，P＜0.05)。见图1。

图1 Western印迹检测IL-18蛋白表达

半定量RT-PCR显示:低转移细胞株未检测到IL-18 mRNA的表达，高转移的NSCLC细胞株的IL-18 mRNA表达水平高达5.41±1.20，两者比较差异显著(t=8.09，P＜0.05)。见图2。

图2 半定量RT-PCR检测IL-18 mRNA表达

2.2 IL-18基因导入癌低转移株后对转染细胞体外迁移的影响 导入IL-18基因的NSCLC低转移株的转移能力为空白对照细胞株的3倍左右，两者比较差异具有统计学意义(t=10.34，P ＜0.05)。

3 讨论

IL-18 具有诱导肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-1β、IL-12、IFN-γ等细胞因子合成，诱导Th1辅助细胞分化，增强NK细胞的细胞免疫功能等作用〔3〕。

IL-18在NSCLC病情发生与发展中发挥了重要的作用。肿瘤转移程度是由肿瘤组织转移能力与免疫抑制肿瘤相互作用的结果决定的，研究〔4〕发现:IL-18具有调节肿瘤细胞增殖、转移、免疫及血管生成的作用，能抑制肿瘤发生、发展及促进肿瘤相关重要因子的合成。IL-18通过免疫激活作用实现抑制肿瘤发展的作用，表现在直接或间接启动IFN-γ的活性、加强T细胞的增殖能力〔5〕。IL-18促进NK细胞的毒性效应，在结肠癌肝转移鼠模型中，脾内注射IL-18后，血清中的一氧化碳(CO)水平显著升高，巨噬细胞毒性增强，提示IL-18可显著增强细胞毒性作用〔6〕。有研究〔7〕证实了转染IL-18稳定性骨髓基质干细胞株对脑神经胶质瘤具有明显的抑制作用。杨文刚等〔8〕也同样证实了IL-18基因转染的肺癌细胞株增殖显著减慢，转移与侵袭能力显著减弱，推测IL-18通过影响免疫功能与增加NK细胞的毒性效应发挥明显的抗肿瘤作用。IL-18对肿瘤转移程度影响的研究少，尚无可证实IL-18抑制肿瘤转移的确切报道〔9〕。以往研究〔10〕采用外周血单核细胞作为IL-18的扩增模板，在细胞组织研究中的可信度不高，本研究采用细胞逆转录形成的cDNA作为模板，不仅为研究IL-18提供了新的路径，还可提高研究的可靠程度。

本研究提示IL-18在NSCLC的转移中发挥着重要的作用。扩增的IL-18基因序列与GenBank公布的序列相符，无基因突变出现，揭示了IL-18在NSCLC高转移中组成性表达。有关研究〔11〕表明IL-18通过促进肝血窦内皮细胞的血管细胞黏附分子(VCAM-1)生成促进肿瘤肝转移，但也有研究〔12〕表明IL-18通过降低IL-6水平抑制肝癌细胞的骨转移。目前为止，对于IL-18在肿瘤中的生物学活性尚有争议，有待进一步探讨。

1 赖远波，陈淡森.揭阳地区汉族人群白细胞介素18基因启动子多态性与结核病的相关性〔J〕.广东医学，2013;34(16):2553-5.

2 周喜云.大肠癌术后患者营养状态与血清中肿瘤坏死因子-α、IL-18和IL-23的关系〔J〕.中国老年学杂志，2013;33(17):4340-1.

3 闭肇龙，侯恩存，吴 波，等.血清IL-18对肝细胞癌患者的预后价值〔J〕.中国现代医学杂志，2013;23(22):34-7.

4 邵 奇，王 宁.白细胞介素-18与肿瘤侵袭转移相关性的研究现状〔J〕.中华肿瘤防治杂志，2012;19(7):547-52.

5 Bian C，Wang ZC，Yang JL，et al.Up-regulation of interleukin-23 induces persistent allodynia via CX3CL1 and interleukin-18 signaling in the rat spinal cord after tetanic sciatic stimulation〔J〕.Brain Behav Immun，2013;1591(13):596-5.

6 陈志芬，邓长生，冯茂辉，等.人白细胞介素-15与18协同增强肿瘤浸润淋巴细胞体内对结肠癌细胞的杀伤功能〔J〕.中华实验外科杂志，2010;27(8):1041-5.

7 蒋常文，夏春波，李鸿文，等.外源性IL-18基因表达对C6胶质瘤细胞侵袭力和克隆形成的影响〔J〕.中华临床医师杂志(电子版)，2010;4(10):2001-3.

8 杨文刚，刘俊华，陈嘉宝，等.白细胞介素-18mRNA在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义〔J〕.现代肿瘤医学，2011;19(12):2426-8.

9 蒋代凤，邢桂春，陈筱潇，等.白细胞介素18在肺癌细胞的表达及其在肿瘤转移中功能的初步探讨〔J〕.免疫学杂志，2003;19(5):355-60.

10 蒋常文，夏春波，李鸿文，等外源性IL-18基因转染联合顺铂对胶质瘤C6细胞凋亡的诱导作用〔J〕.山东医药，2010;50(31):13-5.

11 张在云，李晓梅，王涓冬.IL-18基因修饰对肺癌细胞来源exosome诱导杀伤肿瘤细胞作用的影响〔J〕.中国病理生理杂志，2011;27(9):1758-61.

12 Krzanowski M，Janda K.Dumnicka P-Relationship between aortic pulse wave velocity，selected proinflammatory cytokines，and vascular calcification parameters in peritoneal dialysis patients〔J〕.J Hypertens，2014;32(1):142-8.