急性冠状动脉综合征与辅助T细胞活性增强的观察

直 强 蒋春焕 孙筱倩 (鹤壁京立肿瘤医院内科，河南 鹤壁 458030)

冠状动脉疾病(CAD)是血管腔阻塞和血管内壁炎症之间相互作用所致〔1〕，存在于动脉粥样病变中T细胞特别是其发挥致动脉硬化和斑块失稳定作用而导致病变恶化〔2〕。但是，CAD的炎症途径活化并不仅限于CAD灶而且包括刺激循环性单信心细胞和淋巴细胞〔3〕。T淋巴细胞分化为T辅助(Th)1和Th2亚群，具有不同的特征性细胞因子表达、黏附机制、效应器作用形式、心脏局部免疫反应。Th1细胞表达独特的细胞因子属性，包括干扰素(IFN)-γ、肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-2;Th2细胞主要分泌IL-4和IL-10〔4〕。信号转导和转录激活(STAT)因子家族调节Th1和Th2细胞分化。有推测认为STAT4控制IL-12介导Th1分化，而STAT6控制IL-4引发Th2发生〔5〕。稳定性心绞痛(SA)、急性冠状动脉综合征(ACS)、进展性心肌梗死(STEMI)，心肌梗死而完全无症状及未确定心肌梗死(UH)之间的区别仍然存在问题。前期研究表明ACS和UH患者之间存在不同的免疫活性形式〔5，6〕，T细胞活性形式的差异并不明显。本研究旨在观察SA和ACS及健康对照组间循环T细胞的活性特征。

1 材料和方法

1.1 研究对象 65例住院病人诊断为CAD纳入研究。入院后尽快采集静脉血标本，C-反应蛋白(CRP)、白细胞计数、胆固醇、血糖、肌钙蛋白-Ⅰ、肌酸激酶(CK)等均按照常规方法检测。病人分组见表1示。18例患者符合加拿大心血管协会分级Ⅱ和ⅢSA(组Ⅰ)并至少有1处冠状动脉狭窄(血管造影证实狭窄达50%以上);28例诊断为ACS并入住心血管内科监护室(CCU)，以持续性胸痛在6 h内入院;其中16例(组Ⅱ)属于BraunwaldⅡ或Ⅲ级，表现为一过性ST段压低和(或)T波倒置但无心肌梗死证据。12例ACS患者呈现STEMI(组Ⅲ)，CK水平上升(394 U，297～521 U)，心肌蛋白Ⅰ上升(87 ng/ml，34～123 ng/ml)。19例病人发生持续性胸痛6 h，伴ST-段抬高和CK(392 U/L，213～629 U/L)与心肌钙蛋白Ⅰ(79 ng/ml，14 ～187 ng/ml)增高，无缺血性心脏病病史或慢性SA病史或急性事件、或最近6个月内症状恶化，这些病人为组 Ⅳ(UH)。STEMI和UH确定文献〔5〕。所有病人住院后均进行血管造影检查。排除标准:6个月内心肌梗死;症状发生后6 h以上住院;急性炎症疾病;自身免疫疾病;肿瘤。组V为16例健康成人，这些人具有正常的心电图表现，超声心动图检查无明显异常，无动脉粥样硬化证据。

1.2 CD4+T淋巴细胞分离、mRNA分离、半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)单核细胞分离从肝素化血标本由聚蔗糖密度梯度离心分离，分离后的单核细胞应用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤2次并重新在PBS中悬浮得到107细胞/ml。CD4+T淋巴细胞应用MACS-CD4+磁性细胞分离珠分离，mRNA分离采用(Dynal，Oslo，Norway)和 cDNA 合成参照文献〔7〕。

1.3 细胞染色和流式细胞仪检测 肝素化全血应用RPMI1640 稀释(1∶1)，应用 1 μg/ml佛波酯和50 μg/ml离子霉素加入500 μg/ml的布雷菲德菌素 A(均为 Sigma-Aldrich，Poole，United Kingdom)刺激细胞，标本在37℃ 5%CO2条件下培育4 h，以最大限度活化T细胞和积聚细胞内的细胞因子〔8〕。刺激和未刺激(仅用 Brefeldin A)样本应用CD3-PerCP a抗体(mouse IgG1 anti-human，clone SK7，Pharmingen，San Jose，California)在室温下染色15 min。红细胞溶解采用荧光激活细胞分类(FACS)细胞溶解缓冲液(BDIS，San Jose，California)。淋巴细胞应用PBS 0.5%牛血清白蛋白及0.1%叠氮化钠洗涤，此后在FACS通透液BDIS培育10 min，然后将细胞洗涤2次并用IFN-γ-荧光素异硫氰酸盐(mouse IgG 2b anti-human，clone 25723.11)和 IL-4-藻红蛋白 (mouse IgG1 anti-human，clone 3010.211)抗体(或IgG 2b荧光素异硫氰酸盐IgG1藻红蛋白同型对照，均为Pharmingen产品)在室温下染色30 min。最后将样本洗涤1次，然后重悬于1%的多聚甲醛PBS，以进行流式细胞分析(BDIS)。检测CD3+T细胞亚群和细胞因子IL-2及IFN-γ水平及STAT 4 mRNA水平。

1.4 统计学方法 采用JMP统计软件(SAS Institute Inc，Cary，North Carolina)，piro-Wilk检验用于确定 数值是否符合正态分布，不符合正态分布，两组间比较应用Wilcoxon检验，多组间比较采用Kruskal-Wallis检验。连续变量比较应用t检验，分级变量比较采用χ2检验。CRP、低密度脂蛋白胆固醇、心肌钙蛋白I及CK值以中位值和范围值表达，其他变量以s表示或数值(%)。Spearman相关确定mRNA转录水平和IFN-γ-生成T细胞数量之间的相对关系。

2 结果

2.1 病人特征 SA、ACS、UH病人组间比较年龄、性别、血脂或血糖、吸烟情况或药物应用无显著差异。ACS或UH病人组CAD病变更重，见表1。

表1 一般资料(s)

表1 一般资料(s)

与 STEMI和 UH比较:1)P＜0.01;2)P＜0.05

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2.2 IFN-γ和IL-4生成T细胞频数评估 SA和UH组与对照组比较T细胞活性分别较对照值增高1.9和1.7倍，虽然仅SA组病人达到统计学显著性(P＜0.01)。冠心病症状不稳定与增高的 IFN-γ+/CD3+表达相关，ACS病人组较对照值增高4.6倍，SA组增高2.4倍，UH组增高2.7倍(P＜0.001)。UA组和STEMI组间比较差异无统计学意义(P=0.68)，高水平的肌钙蛋白和低水平的肌钙蛋白患者比较差异亦无统计学意义(P=0.53)。相反，循环性 Th2细胞(IL4+/CD3+群)或 Th0细胞(IL4+/IFN-γ+/CD3+群)级间比较差异无统计学意义。

2.3 Th0、Th1及Th2细胞因子和STAT4和STAT6转录水平应用RT-PCR扩增后应用FACS分析mRNA的表达。Th1信号转换STAT4转录水平在UA〔(1.3±0.2)U，P＜0.01〕及 STEMI〔(1.4±0.3)U，P＜0.01〕均较其他组高〔对照组(0.5±0.1)U;SA组(0.7±0.3)U;UH组(0.6±0.1)U〕。SA组和UH组患者与对照组比较STAT4的mRNA水平增高，但仅SA组患者达到统计学显著水平(P＜0.05)。相似的结果也见于Th1标记细胞因子IL-2和 IFN-γ，UA 组和 STEMI组 IL-2 mRNA(1.5±0.3)及(1.4±0.2)比 SA、UH组及对照组 mRNA转录水平增高〔(0.7±0.2)、(0.5±0.1)、(0.3±0.1)，P ＜0.01〕。对照组、SA组、UA组、STEMI组与UH组IFN-γ转录水平分别为(0.3±0.2)、(0.5±0.2)、(1.3±0.3)、(1.4 ±0.5)及(0.5 ±0.1)，SA和UH组患者IL-2和IFN-γ水平比对照组增高，仅SA组患者达到统计学差异(P＜0.05)。见图1。Th2信号转换STAT6相对转录水平、Th2标记细胞因子IL-4和IL-10各级之间比较差异无统计学意义。循环性IFN-γ+/CD3+淋巴细胞和IFN-γ的mRNA 转录水平(r=0.68，P ＜0.01)、STAT4(r=0.88，P ＜0.001)之间各组均呈强相关。

3 讨论

众多的证据表明，不稳定的动脉粥样硬化病变与全身免疫活性相关〔3，6，9，10〕。本研究结果提示 2 个重要发现:其一，虽然稳定性CAD病人和ACS病人具有相似的CAD病变，但ACS病人显示循环性活化CD3+T细胞扩张，其表现型以Th1淋巴细胞为主。患者的Th1细胞活性增强，在心肌损害前即可观察到，在STEMI患者仍然呈增高表现。其次，UH患者有更重的动脉粥样硬化病变负担，他们的冠状动脉阻塞程度亦重，而T细胞活性水平与SA患者相当。

本研究结果与以往报道发现炎症刺激、阻塞性病变相一致，可出现于整个冠状动脉粥样硬化过程中〔11〕，UA患者可呈现时间依赖性的免疫系统活化〔2，10〕。急性炎症在UA患者的存在，受到其他临床研究结果支持，这些研究证实非特异性炎症标记物、ILs和 IFN-γ、活化 T淋巴细胞及单核细胞增高〔3～5，10，11〕。体外的动物研究对 Th1 驱动的免疫反应在动脉粥样硬化中的重要性进行重点观察。来自动脉粥样硬化供体的CD4+T细胞转接到免疫缺陷鼠则加重了动脉粥样硬化进程。反之，T细胞转移伴有增强的全身IFN-γ水平〔12〕。此外，鼠发生动脉粥样硬化病变可受到Th1药物阻断的抑制，通过IL-10刺激Th2分化对抗Th1分化也可抑制这一病变过程〔11，12〕。而且，来自冠心病患者的资料显示周围循环性T细胞随着临床明显的动脉粥样硬化病变时间发生变化，痉挛性心绞痛病人显示以 Th1 反应占优势〔3，13〕。

两种T细胞亚群的信号因子程序(STAT4和STAT6)和CAD不同阶段之间的关系的报道极少。本研究发现可进一步证明Th1细胞的活性在CAD演变的整个过程中都是增强的。以往研究显示，定向性降低转录因子STAT4导致转基因鼠心脏移植物血管病变减弱〔14〕。本研究结果显示SA和ACS与外周循环T细胞的STAT4转录水平上调相关。Th1细胞活化的程度在UH患者较ACS患者明显要低。UH患者更可能呈现为多支血管病变，其梗死相关血管的狭窄程度亦较ACS患者更显著。冠状动脉狭窄和IFN-γ-CD3+T细胞频数之间缺少关联已经得到证明〔11〕，人体动脉斑块T细胞的数量与整个斑块的形态学相关，更稳定的纤维斑块中T细胞数量低而易破裂斑块中T细胞数量高。T细胞积聚在病灶的肩区，此区通常是最厚的顶部，炎症细胞浸润最严重，最容易发生破裂〔13〕。因此，T细胞活化可能不是患者固定性阻塞病变的驱动因素，而易受侵袭和易受影响的新陈代谢活跃斑块的不稳定性是更基本的原因。易受影响的斑块特征性的组织形态学特征包括高脂含量、炎症细胞数量增多、广泛性新血管形成。T细胞通过吸引和活化白细胞与巨噬细胞而促进免疫反应蔓延，此外，也与降低平滑肌细胞群、诱导内皮细胞损伤、部分地由于IFN-γ诱导一氧化氮产物的调节异常等相关〔11～13〕。活化T细胞还抑制基质合成，主要是通过IFN-γ生成和促使易受侵袭斑块内的凋亡过程〔14〕。因此，斑块产生的非血流限制性狭窄似可解释其较更严重狭窄呈现更多见的斑块破裂和血栓形成。

总之，Th1膨胀与心肌损害指标的短暂关系支持细胞免疫反应活化和上调的免疫介质对斑块不稳定性有影响。

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