补阳还五汤对APP/PS1双转基因小鼠学习记忆及海马组织白介素＆x100ccf;6水平的影响

费洪新，韩玉生，杜徽，姜波，李宝龙，朴成玉，张英博，仲丽丽，白云，周忠光

（1.黑龙江中医药大学中医药研究院，哈尔滨 150040；2.齐齐哈尔医学院基础医学院，黑龙江 齐齐哈尔 161000）

补阳还五汤（Buyang Huanwu Decoction，BHDWD）是中国古代活血祛瘀的方剂之一，其主要成分是黄芪甲苷、阿魏酸、芍药苷、红花黄色素等，具有补气、活血、通络等功效［1］。近年来本课题组成员应用BHDWD对阿尔茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）动物模型开展多项研究，如BHDWD提高大鼠血清胰岛素水平［2］、BHDWD降低大鼠β淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）表达［3］、BHDWD降低细胞因子水平［4］、BHDWD增强免疫功能［5］等。APP与早老素1（presinilin＆x100ccf;1，PS1）密切相关，尽管对BHDWD的研究较多，但是BHDWD对AD的新模型APP/PS1双转基因小鼠的研究尚属空白。因此本实验采用AD模型APP/PS1双转基因小鼠为研究对象，施加BHDWD处理因素进行干预，观察BHDWD对APP/PS1双转基因小鼠学习记忆能力的影响，并且在此基础上分析炎性相关因子白介素＆x100ccf;6（interleukin＆x100ccf;6，IL＆x100ccf;6）的变化。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器：Morris水迷宫（安徽淮北正华生物仪器设备有限公司）；6100型RT＆x100ccf;雷杜酶标仪（美国RT公司）；电子天平（沈阳龙腾电子称量仪器有限公司）。

1.1.2 药品和试剂：BHDWD（黑龙江中医药大学附属第一医院购买、田明教授制备）；吡拉西坦片（湖南迪诺制药有限公司，批号130325）；IL＆x100ccf;6酶联免疫试剂盒（批号20140401，南京建成生物工程研究所生产）；其他试剂均为国产分析纯。

1.1.3 动物：健康、雄性、3月龄、清洁级、体质量（23±2）g、APP/PS1双转基因小鼠［B6.Cg＆x100ccf;Tg（APPswe，PSEN1dE9）85Dbo/Mmjax］，由哈尔滨医科大学解剖教研室吴树亮教授赠送，动物自由摄取食物、饮用纯净水、常温、常湿饲养于黑龙江中医药大学实验动物中心，另外对照组小鼠（北京维通利华实验动物技术有限公司提供，SCXK（京）2012-0001与模型小鼠的饲养条件相同。

1.2 方法

1.2.1 APP/PS1双转基因小鼠基因鉴定：APP/PS1双转基因种鼠经过传代产下小鼠3周后鼠尾剪断0.5 cm，提取基因组DNA，设计APP基因350 bp引物（上游：5′＆x100ccf;CACCACAGAATCCAAGTCGG＆x100ccf;3′，下游：5′＆x100ccf;CTTGACGTTCTGGCCTCTTCC＆x100ccf;3′），其余按Qiagen DNeasy Blood＆amp;Tissue Kit说明书进行，筛选出APP/PS1双转基因小鼠用于实验研究。

1.2.2 小鼠分组及其给药：APP/PS1双转基因小鼠共60只，随机分5组：模型组12只给予生理盐水灌胃、治疗组12只给予吡拉西坦片（0.62 g·kg-1·d-1）灌胃、BHDWD高剂量组12只给予37.06 g·kg-1·d-1灌胃、BHDWD中剂量组12只给予18.53 g·kg-1·d-1灌胃、BHDWD低剂量组12只给予9.26 g·kg-1·d-1灌胃，另设立同月龄、同背景的C57小鼠对照组12只给予生理盐水灌胃。灌胃时间每天上午8时，持续时间为4周。

1.2.3 BHDWD对APP/PS1双转基因小鼠定位航行能力的影响：采用Morris水迷宫测试小鼠的学习能力，各组小鼠末次给药1 h后进行Morris水迷宫测试。Morris水迷宫水深20 cm，高于平台1 cm，水温控制在（23±2），平台放于第象限，第1、2、3、4天时间为训练时间，第5天为测试时间，每次训练时间为60 s，若60 s内未找到平台，则将小鼠引至平台停留20 s，此时潜伏期记为60 s，小鼠每次训练后都要在平台上停留20 s，测试时撤去平台，观察小鼠到达平台位置的时间，就是检测定位航行能力的潜伏期时间，每只小鼠选择3个不同的象限进行测量，每组12只小鼠，即每组测得36个数值，再取平均值，进行统计分析。

1.2.4 BHDWD对APP/PS1双转基因小鼠空间探索能力的影响：采用Morris水迷宫测试小鼠的记忆能力，过程同上，在测试第5 d的时候撤去平台，检测在60 s内小鼠找到平台的游泳距离作为衡量小鼠的空间探索能力的实验结果，反映小鼠记忆能力的指标。

1.2.5 BHDWD对APP/PS1双转基因小鼠游泳轨迹的影响：采用Morris水迷宫观察小鼠的游泳轨迹，过程同上，游泳轨迹一般分为边缘型、趋化型、直线型3种，采用图形的方式直观反映小鼠的空间学习记忆综合能力。

1.2.6 BHDWD对APP/PS1双转基因小鼠海马IL＆x100ccf;6的影响：小鼠水迷宫实验结束后，低温迅速断头取海马组织、匀浆、静置、离心、分装、低温保存。采用双抗体夹心法，按IL＆x100ccf;6酶联免疫试剂盒说明书进行，450 nm波长测定各孔OD值，根据标准曲线计算出海马IL＆x100ccf;6浓度。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 动物小鼠基因的鉴定

结果表明，1、4、6三个样本无APP基因，2、3、5、7四个样本有APP基因，确定2、3、5、7四个样本是APP/PS1双转基因小鼠，依此方法鉴定APP/PS1双转基因小鼠（图1）。

图1 APP/PS1双转基因小鼠基因鉴定（PCR法）Fig.1 Gene identification of APP/PSI double transgenic mice（polymerase chain reaction method）

2.2 BHDWD对APP/PS1双转基因小鼠定位航行能力的影响

结果表明，与对照组比较，模型组小鼠潜伏期明显增加（P＆lt;0.05）；与模型组比较，治疗组、高剂量组、中剂量组的小鼠潜伏期明显缩短（P＆lt;0.05）；与模型组比较，低剂量组的小鼠潜伏期改变差异无统计学意义（P＆gt;0.05，表1）。

2.3 BHDWD对APP/PS1双转基因小鼠空间探索能力的影响

表1 BHD对APP/PS1双转基因小鼠海马组织潜伏期的影响（±s，n=12）Tab.1 Effect of BHD on the latencies of hippocampal tissue in APP/PS1 double transgenic mice（±s，n=12）

表1 BHD对APP/PS1双转基因小鼠海马组织潜伏期的影响（±s，n=12）Tab.1 Effect of BHD on the latencies of hippocampal tissue in APP/PS1 double transgenic mice（±s，n=12）

1）P＆lt;0.05 compared to control group；2）P＆lt;0.05，3）P＆gt;0.05 compared to model group.

Group Dosage（g·kg-1·d-1） Latencies（s）Control group - 17.950 8±10.462 7 Model group - 40.885 0±12.961 51）Treatment group 0.62 19.611 7±10.203 82）High dose group 37.06 28.375 0±13.140 52）Medial dose group 18.53 25.469 2±9.519 22）Low dose group 9.26 36.994 2±11.295 93）

结果表明，与对照组比较，模型组小鼠游泳距离明显增加（P＆lt;0.05）；与模型组比较，治疗组、高剂量组、中剂量组的小鼠游泳距离明显缩短（P＆lt;0.05）；与模型组比较，低剂量组的小鼠游泳距离改变差异无统计学意义（P＆gt;0.05）；与治疗组比较，高剂量组的小鼠游泳距离明显延长（P＆lt;0.05），中剂量组的小鼠游泳距离改变差异无统计学意义（P＆gt;0.05，表2）。

表2 BHD对APP/PS1双转基因小鼠游泳距离的影响（±s，n=12）Tab.2 Effect of BHD on swimming distances of APP/PS1 double transgenic mice（±s，n=12）

表2 BHD对APP/PS1双转基因小鼠游泳距离的影响（±s，n=12）Tab.2 Effect of BHD on swimming distances of APP/PS1 double transgenic mice（±s，n=12）

1）P＆lt;0.05 compared to control group；2）P＆lt;0.05，3）P＆gt;0.05 compared to model group；4）P＆lt;0.05，5）P＆gt;0.05 compared to treatment group.

Groups Dosage（g·kg-1·d-1） Swimming distances（cm）Control group - 625.583 3±194.140 0 Model group - 1286.175 8±132.135 01）Treatment group 0.62 709.400 0±173.284 92）High dose group 37.06 868.870 8±186.985 12），4）Medial dose group 18.53 754.148 3±141.388 42），5）Low dose group 9.26 1180.068 3±121.275 83）

2.4 BHDWD对APP/PS1双转基因小鼠游泳轨迹的影响

图2 BHD对APP/PS1双转基因小鼠海马组织第Ⅰ象限游泳轨迹的影响Fig.2 Effect of BHD on swimming trajectory of the first quadrant of hippocampal tissue in APP/PS1 double transgenic mice

图3 BHD对APP/PS1双转基因小鼠海马组织第Ⅱ象限游泳轨迹的影响Fig.3 Effect of BHD on swimming trajectory of the second quadrant of hippocampal tissue in APP/PS1 double transgenic mice

图4 BHD对APP/PS1双转基因小鼠海马组织第Ⅲ象限游泳轨迹的影响Fig.4 Effect of BHD on swimming trajectory of the third quadrant of hippocampal tissue in APP/PS1 double transgenic mice

2.5 BHDWD对APP/PS1双转基因小鼠海马组织IL＆x100ccf;6的影响

结果表明，与对照组比较，模型组小鼠海马组织IL＆x100ccf;6含量明显升高（P＆lt;0.05）；与模型组比较，治疗组、高剂量组、中剂量组小鼠海马组织IL＆x100ccf;6的含量明显降低（P＆lt;0.05）；与模型组比较，低剂量组小鼠海马组织IL＆x100ccf;6含量降低不明显（P＆gt;0.05，表3）。

表3 BHD对APP/PS1双转基因小鼠海马组织IL＆x100ccf;6的影响（±s，n=12）Tab.3 Effect of BHD on IL 6 of hippocampal tissue in APP/PS1 double transgenic mice（±s，n=12）

表3 BHD对APP/PS1双转基因小鼠海马组织IL＆x100ccf;6的影响（±s，n=12）Tab.3 Effect of BHD on IL 6 of hippocampal tissue in APP/PS1 double transgenic mice（±s，n=12）

1）P＆lt;0.05 compared to control group；2）P＆lt;0.05，3）P＆gt;0.05 compared to model group.

Group Dosage（g·kg-1·d-1）Hippocampal（ng·mL-1）Control group - 6.514 1±0.618 9 Model group - 9.495 6±0.566 01）Treatment group 0.62 7.102 1±0.434 12）High dose group 37.06 8.506 9±0.421 02）Medial dose group 18.53 7.834 4±0.500 72）Low dose group 9.26 9.316 3±0.479 93）

3 讨论

AD经常隐匿起病，出现进行性的智能衰退，经常伴有人格的障碍，在AD的发生早期表现为学习、记忆能力的减退，基于此本实验主要检测APP/PS1双转基因小鼠的学习记忆能力，并且探寻与小鼠学习、记忆能力相关的细胞因子。

AD的发病机制复杂，细胞因子也参与AD的发生机制。细胞因子由淋巴细胞和单核细胞产生，对机体起到调节作用，在AD的发生中会出现小胶质细胞炎性反应，炎症初期小胶质细胞表达吞噬受体清除AD的核心成分、老年斑的主体结构β＆x100ccf;淀粉样蛋白（amyloidbeda protein，Aβ）［6］，Aβ使小胶质细胞激活释放，小胶质细胞又可以使Aβ产生增加，形成瀑布式效应，导致Aβ增加，使机体AD的症状加剧。在引发AD时，主要的细胞因子是IL＆x100ccf;6、TNF＆x100ccf;α、IL＆x100ccf;1β等［7，8］。基于此，本实验同时开展对IL＆x100ccf;6的检测。

AD的研究有很多模型，例如快速老化小鼠模型、注射D＆x100ccf;半乳糖模型、注射Aβ模型、铝中毒模型、转基因模型等［9］。近年来很多研究者采用APP/PS1双转基因小鼠来开展实验［10～12］。APP/PS1双转基因小鼠是在C57小鼠幼年时期就转入2种AD相关基因，制备AD模型，基于此本实验采用APP/PS1双转基因小鼠为研究对象，以中国古老的方剂BHDWD为处理因素，主要研究BHDWD对APP/PS1双转基因小鼠海马组织的保护作用。

实验潜伏期、游泳距离的检测中，随着训练次数的增加，潜伏期、游泳距离整体呈现下降的趋势。第5天与对照组比较，模型组小鼠游泳距离明显增加，说明模型建立成功，模型稳定；第5天测试后与模型组比较，治疗组、高剂量组、中剂量组小鼠游泳距离明显缩短，说明高剂量、中剂量的BHDWD对APP/PS1双转基因小鼠的治疗也有效果；但是第5天测试后与模型组比较，低剂量组小鼠游泳距离改变不明显，也说明低剂量的BHDWD对AD小鼠治疗效果较差，以上综合提示在临床治疗中，应该选择高、中剂量BHDWD。中剂量BHDWD对APP/PS1双转基因小鼠的记忆能力改善明显，高剂量的BHDWD虽然有效果，但是有一定的不良反应，因此建议选择中剂量BHDWD效果较好。

实验游泳轨迹的观察中显示模型组、低剂量组小鼠的游泳轨迹多为边缘型，说明低剂量的BHDWD改善APP/PS1双转基因小鼠空间学习记忆能力不明显；对照组、治疗组、高剂量组、中剂量组小鼠的游泳轨迹多为直线型和趋化型，说明高剂量、中剂量的BHDWD可以提高AD小鼠的空间学习记忆能力，并且中剂量的BHDWD与吡拉西坦片的图形接近，进一步说明中剂量的BHDWD改善AD小鼠学习记忆能力较好。

实验中检测细胞因子IL＆x100ccf;6，与对照组比较，模型组AD小鼠海马组织IL＆x100ccf;6含量明显升高，说明模型组炎性反应明显，模型建立成功；治疗后与模型组比较，治疗组、高剂量组、中剂量组APP/PS1双转基因小鼠海马组织IL＆x100ccf;6的含量明显降低，提示高、中剂量的BHDWD对改善AD小鼠炎性反应症状明显，说明高、中剂量BHDWD对AD治疗效果较好；经过BHDWD治疗后与模型组比较，低剂量组小鼠海马组织IL＆x100ccf;6含量较高，说明低剂量BHDWD对改善AD小鼠IL＆x100ccf;6水平效果不好。通过对细胞因子IL＆x100ccf;6的检测中提示IL＆x100ccf;6与AD密切相关，并且中剂量的BHDWD对改善APP/PS1双转基因小鼠效果较好

总之，本研究发现BHDWD改善APP/PS1双转基因小鼠学习、记忆能力，降低IL＆x100ccf;6的水平，说明BHDWD通过下调海马组织IL＆x100ccf;6的水平来干扰炎症的损伤过程，减轻AD的症状，保护小鼠海马组织结构，改善APP/PS1双转基因小鼠的学习、记忆能力。关于BHDWD治疗AD的作用机制，本课题组将继续深入开展RAGE/LRP1受体系统的研究，探寻BHDWD治疗AD的新靶点。

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