当归补血汤对脓毒症小鼠脾脏Treg细胞比例、Foxp3 mRNA表达的影响

刘 涛，黄瑞峰，王 毅

(贵阳中医学院第一附属医院，贵阳550002)

脓毒症病死率较高，目前研究认为细胞免疫功能紊乱在其发病中发挥了重要作用。调节性T细胞(Treg)作为CD+4T细胞亚群之一，不仅能控制自身免疫反应，也是调节炎症、感染、移植排斥和肿瘤免疫的重要细胞群［1，2］。Foxp3是 Treg的特异性转录因子，也是调节Treg发育和功能的关键因子。IL-2、TGF-β 可影响 Foxp3 基因转录［3，4］，调控机体免疫功能。诸多研究已表明，当归补血汤具有免疫调节功能，本研究旨在观察当归补血汤水煎剂及当归补血汤多糖能否通过调节脓毒症小鼠脾Treg细胞的发育，从而发挥免疫调节作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 当归补血汤水煎剂和当归补血汤多糖的制备 当归和黄芪产地为内蒙古，购自贵州省中医院药房。将黄芪和当归按5∶1比例混合，依照传统方法分别水煎煮3次混合加热浓缩成1 g/mL的当归补血汤水煎剂，冷却后装瓶置于4℃冰箱中保存备用。当归补血汤多糖用Sevag法［5］提取，当归补血汤多糖含量为31.5 mg/g。

1.1.2 实验动物 清洁级C57BL/6小鼠(野生型)80只，20 d龄，雌雄各半，体质量9～12 g，常规动物饲料喂食(均由贵阳医学院实验动物中心提供，饲料执行标准GB/T 14924.9-2001)。

1.1.3 主要试剂和仪器 小鼠IL-2 ELISA试剂盒购自四川阿比丁生物工程有限公司;CD4-PE、CD8-PE单克隆抗体为美国BD公司产品。荧光标记抗体(PF-anti-CD25/FITC-anti-CD4)购自美国 Serotec公司。流式细胞仪购自美国BD公司。PCR引物由四川阿比丁生物工程有限公司合成:β-actin上游引物为5'-CCTC TATG CCAA CACA GTGC-3'，下游引物为5'-GTAC TCCT GCTT GCTG ATCC-3';Foxp3上游引物为5'-GTGG CCTC AGTG GACA AGAGC-3'，下游引物为5'-TGTC TCCG CACA GCAA ACAA G-3'。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及处理 80只小鼠随机分成正常对照组、模型对照组、当归补血汤组、当归补血汤多糖组，各20只。正常对照组、模型对照组灌服0.2 mL无菌生理盐水，1次/d，连续15 d;当归补血汤组灌服当归补血汤水煎剂0.35 g/kg，当归补血汤多糖组灌服当归补血汤多糖15 mg/kg，1次/d，连续15 d。第15天时，除正常对照组外，其余各组均注射内毒素(10 mg/kg)，正常对照组注射相同体积生理盐水。各组随机抽取10只小鼠，观察各组96 h死亡情况;每组其余10只小鼠于注射生理盐水或内毒素后8 h处死，于酒精中浸泡1 min后无菌切取小鼠脾脏，留取300 mg及100 mg各1块脾组织备用。经心脏采集各组小鼠血液5 mL，高速低温离心后取血清于-80℃冷冻保存。

1.2.2 血清IL-2、TGF-β 检测 采用ELISA法。操作按试剂盒说明书进行。

1.2.3 脾脏Treg细胞比例检测 采用流式细胞术。取脾组织约300 mg，常规制备脾细胞悬液。取脾细胞悬液，分别加入细胞标记抗体 CD4-ECD、CD25、PC5-CD127-PE及相应的同型对照单抗各10 μL，混匀，温室避光孵育15 min，加入 1.5 mL 红细胞裂解液。混匀后室温避光放置10 min，破坏红细胞，1 500 r/min离心5 min，弃上清，每管加入1.5 mL PBS混匀，1 500 r/min离心5 min。弃上清，重复1次，0.5 mL PBS重悬细胞。2 h内用三色流式细胞仪术检测。CD+4CD25+CD-127细胞即为Treg细胞。计算Treg细胞占脾细胞比例及占脾单核细胞比例。

1.2.4 脾脏Foxp3 mRNA表达检测 采用RT-PCR法。取约100 mg脾组织，加入1 mL Trizol试剂，匀浆后用氯仿进行二相分离，溶解至水相的RNA用异丙醇沉淀，离心后清洗RNA沉淀。反转录合成cDNA。对目的基因和管家基因分别进行RT-PCR反应。反应条件:94℃预变性5 min，Foxp3为35个PCR 循环(94 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，87 ℃10 s)，β-actin为35个PCR循环(94℃ 20 s，60℃20 s，72℃ 20 s，86℃ 10 s)。以标准品梯度的测量结果绘制标准曲线，计算各标本所测基因的表达量，各标本目的基因的表达量除以管家基因的表达量，即得到样品校正后的基因相对表达量。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计量数据以±s表示，组间比较采用单因素方差分析。病死率比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 死亡率 正常对照组无小鼠死亡。腹腔注射内毒素9 h后模型对照组小鼠开始出现死亡，观察至96 h共死亡6只(30%);当归补血汤组小鼠注射内毒素后16 h出现首例死亡，至96 h死亡4只(20%);当归补血汤多糖组小鼠注射内毒素后96 h内死亡3只(15%)。模型对照组小鼠死亡率高于其余3组(P均＜0.05)。

2.2 血清IL-2、TGF-β 各组小鼠血清 IL-2、TGF-β水平见表1。由表1可见，模型对照组血清 IL-2、TGF-β水平高于正常对照组(P均＜0.05)，当归补血汤组、当归补血汤多糖组与模型对照组相比，P均＞0.05。

2.3 脾脏中Treg细胞比例 各组小鼠Treg细胞占脾细胞和脾单核细胞比例见表1。由表1可见，当归补血汤组、当归补血汤多糖组Treg细胞占脾细胞及脾单核细胞比例高于模型对照组(P均＜0.05)，上述三组均低于正常对照组(P均＜0.05)，当归补血汤组和当归补血汤多糖组相比，P 均 ＞0.05。

2.4 脾脏Foxp3 mRNA 各组小鼠脾脏Foxp3 mRNA相对表达量见表1。由表1可见，当归补血汤组、当归补血汤多糖组脾脏Foxp3 mRNA相对表达量高于模型对照组(P均＜0.05)，上述三组均低于正常对照组(P均＜0.05)，当归补血汤组与当归补血汤多糖组相比，P均＞0.05。

表1 各组小鼠血清IL-2、TGF-β水平、脾脏Treg细胞比例、Foxp3 mRNA表达水平比较(±s)

表1 各组小鼠血清IL-2、TGF-β水平、脾脏Treg细胞比例、Foxp3 mRNA表达水平比较(±s)

注:与正常对照组相比，*P＜0.05;与模型对照组相比，#P＜0.05

组别 n IL-2(pg/mL) TGF-β(pg/mL) Treg细胞占脾细胞比例(%)Foxp3 mRNA相对表达量正常对照组 20 23.78 ± 7.46 14.72 ± 5.97 4.05 ±1.92 4.28 ±1.42 Treg细胞占脾单核细胞比例(%)5.99 ±1.47模型对照组 20 47.49 ±17.37*30.71 ±13.79* 1.83 ±0.79* 1.25 ±0.42* 0.65 ±0.18*当归补血汤组 20 35.52 ±13.02*37.54 ±12.75* 2.68 ±1.47* 2.52 ±0.35*# 2.83 ±0.31*#当归补血汤多糖组 20 34.18 ±12.13*35.32 ±17.67* 2.61 ±1.32*# 2.62 ±1.26*# 3.36 ±0.36*#

3 讨论

脓毒症常伴免疫调节紊乱，最终引起内环境紊乱，导致组织器官损伤，发生MODS，其发病率持续升高［6，7］。近期流行病学研究证实自1997年后脓毒症休克的发生率呈增加趋势，病死率可达30%［8，9］。一项对三级甲等教学医院ICU患者的调查结果显示，严重脓毒症的发病率和病死率分别为8.68%和 48.70%［10］。因此，脓毒症仍是目前 ICU临床及科研亟需解决的难题。

Treg存在于胸腺和外周淋巴组织中，占外周血CD4+T细胞的1%～2%。天然产生的Treg不同于Th1和Th2细胞，是具有调节功能的细胞群体，对维持机体免疫耐受和免疫应答稳态具有非常重要的作用，IL-2、TGF-β 为其重要的调节因子［11，12］。

现代医学对脓毒症发病机制的认识与中医学有相似之处。中医认为各种严重感染、创伤、大手术等均耗伤人之气血，导致气损血衰。感染属热毒之邪，即《内经》所说的“壮火”，“壮火”耗气又耗血伤阴;而创伤、大手术、病理产科均可出现大出血或合并感染，出血者气随血脱，感染者热毒耗伤气阴，使气血更虚［13］。当归补血汤是经典的益气补血复方［14］。近代研究表明，当归补血汤具有补血、调节免疫功能等药理作用，其临床应用十分广泛。当归补血汤水煎剂主要的有效成分为皂甙类、多糖类、氨基酸类及酮类［15，16］。本研究结果显示，模型对照组小鼠病死率高于当归补血汤组及当归补血汤多糖组。模型对照组小鼠脾脏Treg细胞比例和转录因子Foxp3 mRNA表达量低于正常对照组，给予当归补血汤水煎剂或当归补血汤多糖干预的小鼠脾脏中Treg细胞比例及转录因子Foxp3 mRNA表达量较模型对照组有所提高，但当归补血汤组与当归补血汤多糖组差异无统计学意义。我们还发现，当归补血汤组、当归补血汤多糖组小鼠血清IL-2、TGF-β水平低于模型对照组。上述结果表明当归补血汤水煎剂或多糖上调脾脏Treg细胞比例和Foxp3基因表达不需要小鼠处于免疫被激活状态;Foxp3基因表达的增强反映Treg细胞的功能活性增强，当归补血汤对Treg比例的调节可能是通过直接或间接促进Treg的特异性转录因子Foxp3基因表达来实现的。当归补血汤水煎剂与当归补血汤多糖效果相当，推测当归补血汤多糖可能是当归补血汤发挥作用的有效成分。

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