乳浆大戟提取物对人肺癌细胞A549增殖的影响

杨文杰，向云涛，程建辉，张向红，马繁荣，王爱红

(延安大学医学院，陕西延安716000)

乳浆大戟为多年生草本，是国产大戟属植物中分布最广、变异幅度最大的种之一。乳浆大戟全草入药，具拔毒止痒、利尿消肿之效，但国内外鲜见乳浆大戟抗肿瘤的报道。我们用乳浆大戟提取物作用于体外培养的人肺癌A549细胞，观察其抗肿瘤活性，为进一步开发利用乳浆大戟提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株和主要试剂 人肺癌细胞A549由延安大学医学实验中心实验室保存。噻唑蓝(MTT)、碘化丙锭(PI)、二甲基亚砜(DMSO，Sigma-Aldrich公司，美国);RPMI1640培养基(Invitrogen公司，美国)，四季青新生小牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)，胰酶(Gibco BRL公司，美国)，荧光倒置显微镜及CCD采用Nikon显微镜，流式细胞仪 FACS Calibur(Becton Dickinson公司，美国)，酶标仪采用美国Bio-Rad 680型全自动酶标仪。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人肺癌细胞A549用RPMI1640培养基培养，常规加入10%小牛血清，100 U/mL青霉素，0.1 mg/mL链霉素。置于37℃、5%CO2培养箱中培养。

1.2.2 乳浆大戟提取物制备 乳浆大戟地上全草阴干，用植物捣碎机粉碎，加适量纯水制成混悬液，粗滤纸过滤收集滤液，低温风干称重，加纯水配制成100 g/L，0.22 μm滤器过滤保存于-20℃备用。

1.2.3 乳浆大戟提取物对A549细胞增殖的影响

采用MTT法检测。取对数生长期的A549细胞，以5×104/mL密度接种于96孔板，每孔200 μL。次日细胞贴壁后，更换培养基，对照组未加乳浆大戟提取物，实验组添加乳浆大戟提取物，其终质量浓度为 0.2、0.4、0.8 g/L，每个浓度设 6 个复孔，于培养24、48、72 h 加入 MTT 20 μL/孔(5 mg/mL)，继续孵育4 h，吸弃培养液，加入 DMSO 150 μL/孔，充分混匀，在酶标仪490 nm处测其吸光度(A)值。按照公式计算细胞增殖抑制率:抑制率=［1-(实验组A值/对照组A值)］×100%。实验重复3次。

1.2.4 乳浆大戟提取物对A549细胞形态的影响

采用PI染色法。取对数生长期的A549细胞，以2×105/mL的密度接种于6孔板中，每孔2 mL。次日细胞贴壁后，更换培养基，对照组未加乳浆大戟提取物，实验组添加乳浆大戟提取物，其终质量浓度为0.2、0.4、0.8 g/L，培养48 h 后弃去培养基，2 mL 的PBS液洗2次，加入50 g/L的PI染料，避光染色30 min，弃上清，在荧光显微镜下观察细胞核的形态改变。

1.2.5 乳浆大戟提取物对A549细胞凋亡的影响采用流式细胞仪检测。流式细胞术样品的准备:①药物处理细胞(方法同1.2.4)后，收集细胞(1～5)×106/mL，500～1 000 r/min离心5 min，弃去培养液。②3 mL的PBS液洗1次。③离心去PBS液，加入冰预冷的70%乙醇固定，4℃，1 h。④离心去固定液，3 mL PBS液重悬5 min。⑤400目筛网过滤1次，500～1 000 r/min离心5 min，弃去PBS液。⑥用1 mL的PI染液染色，4℃避光30 min。⑦流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.6 统计学方法 采用 SPSS17.0统计软件。计量资料以±s表示，组间比较用成单因素方差分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乳浆大戟提取物对A549细胞的增殖抑制率结果见表1。

表1 乳浆大戟提取物对A549细胞的增殖抑制率(%，±s)

表1 乳浆大戟提取物对A549细胞的增殖抑制率(%，±s)

注:与0.2 g/L 比较，△P ＜0.05;与0.4 g/L 比较，#P ＜0.05

乳浆大戟提取物(g/L)细胞增殖抑制率24 h 48 h 72 h 0.2 9.3 ±3.5 37.8 ±3.5 27.1 ±6.5 0.4 13.8 ±8.3△ 41.9 ±2.6△ 45.2 ±1.6△0.8 19.2 ±3.9△# 46.3 ±3.2△# 43.1 ±2.8△#

2.2 各组A549细胞形态变化 对照组A549细胞饱满呈梭形，胞质丰富，大小均一，单层贴壁生长，细胞核呈完整椭圆形，细胞数目多，几乎无凋亡细胞。实验组细胞随浓度增加，细胞数目减少，细胞体积变小、变圆，细胞核出现固缩，呈致密强荧光。0.8 g/L实验组的细胞减少，细胞间隙增大，贴壁状态差，细胞变圆，细胞膜皱缩，折光性小，细胞脱落明显，见图1(A为对照组，B为0.8 g/L乳浆大戟实验组)。

图1 乳浆大戟提取物作用A549细胞48 h细胞形态变化(×100)

2.3 各组A549细胞凋亡率比较 对照组细胞凋亡率为5.33% ± 0.67%，实验组 0.2、0.4、0.8 g/L乳浆大载提取物作用后细胞凋亡率分别是15.53%±0.15%、21.42% ±1.01%、46.57% ± 1.76%，实验组与对照组比较，P均＜0.05。

3 讨论

上世纪五六十年代西方医学化学合成药物达鼎盛时期，但从七十年代以来，人们发现化学合成药物具有毒副作用大的缺陷，而天然药物具有毒副作用小的优点，开发成本低［1～3］。从天然产物中寻找保健预防和治疗疾病的有效成分成为国际潮流，天然药物今后将会逐渐成为医药市场的主流［4～6］。

肺癌是世界上发病率和病死率最高的恶性肿瘤之一［7］。化疗是治疗肿瘤的主要手段之一，但化疗常常带来多系统的不良反应。天然药物具有有效成分多、结构多样、抗癌谱广、毒副作用小等特点，已成为开发抗肿瘤药物的新途径。我们课题组采集乳浆大戟的地上全草，提取水溶性组分，经过滤除菌后，作用于体外培养的人肺癌细胞A549，结果显示，乳浆大戟提取物能抑制A549细胞的增殖，最大抑制率是46.3%。

近年来，通过中草药诱导细胞凋亡治疗恶性肿瘤已成为研究的热点之一［8～11］。药物除通过各自的靶点直接作用外，也可以通过诱导细胞凋亡杀伤肿瘤细胞。因此，能否诱导肿瘤细胞凋亡已成为筛选抗癌药物的标准之一［12］。细胞凋亡是一个复杂的生理和病理过程，其信号转导途径主要有两条，即线粒体途径和死亡受体途径。不同的诱因可通过相同的信号转导途径诱发细胞凋亡，不同的信号转导途径不是孤立发挥作用，而是紧密联系、相互作用，整个信号转导系统为复杂的网络状调控结构。本实验结果显示，乳浆大戟提取物处理后的A549细胞出现凋亡细胞的形态特征;流式细胞检测结果显示乳浆大戟提取物可以诱导A549细胞凋亡，但诱导细胞凋亡的机制需要进一步研究。

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