CXCL13及其受体CXCR5与结直肠癌转移及KRAS基因突变关系的探讨

刘彦魁，游庆军，金琳芳，冯静洁，齐晓薇

(无锡市第四人民医院，江苏无锡214062)

淋巴转移是结直肠癌转移的主要方式。瘤细胞浸入淋巴管后，随淋巴流首先到达局部引流淋巴结，之后聚集于边缘窦，继续增殖累及整个淋巴结。结直肠癌伴淋巴转移者预后明显不良，且对放化疗敏感性低［1～3］。CXCL13是趋化因子 CXC 家族的一员，主要分布在人体肝脏、淋巴结和血清中，其编码基因定位于 4q21［4，5］。CXCL13 能够吸附 B 细胞，并参与免疫系统信号的传递。CXCL13与其受体CXCR5共同作用发挥生物学效应，后者主要分布在成熟B细胞上，参与免疫功能微环境的构建，具有协调体液免疫的功能。最近研究表明，CXCL13及其受体CXCR5的表达与恶性肿瘤的发生发展有紧密的关系［6，7］。KRAS基因是结直肠癌的重要相关基因，已有分子靶向药物络氨酸激酶抑制剂用于临床。结直肠癌组织中CXCL13表达是否与KRAS基因有关尚不清楚。2013年1～11月，我们观察了CXCL13及其受体CXCR5对结直肠癌淋巴转移的影响，并探讨其与KRAS基因突变的关系。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 97例结直肠癌原发灶标本(观察A组)和51例转移灶标本(观察B组)为2007～2009年间无锡市第四人民医院手术切除标本，经病理检查确诊;52例正常结直肠标本(对照A组)和43例正常淋巴结标本(对照B组)为2011～2012年该院手术切除标本，经病理诊断为癌症阴性者。观察组结直肠癌患者中男63例，女85例;对照组男45例，女50例。两组入选标本所涉及患者年龄36～77岁，中位年龄49岁。本研究涉及患者标本采集前均签署知情同意书，手术前均未接受放化疗及其他特殊药物治疗。观察组结肠癌84例，直肠癌64例;管状腺癌58例，乳头状腺癌52例，黏液癌31例，未分化癌7例。随访?个月，失访11例，死亡41例，意外死亡4例。

1.2 CXCL13和CXCR5表达检测及结果判定方法采用免疫组化法。CXCR5和CXCL13鼠抗人抗体购自美国R＆D Systems公司，DAB显色剂购自基因科技上海有限公司。标本采集后立即浸入10%中性甲醛液中固定12 h，经病理医生取材后、脱水、透明、包埋，4 μm切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇除去二甲苯，高压锅修复，3%的正常羊血清封闭特异性位点20 min，接着用一抗孵育1 h，二抗孵育30 min，最后用DAB显色。免疫组化结果由两名副主任以上职称医师判读得出。细胞膜和(或)细胞质出现棕褐色为CXCR5或CXCL13阳性。按着色强度评分:无着色得0分，弱阳性得1分，中等强度阳性得2分，强阳性得3分。按阳性细胞比例评分:无细胞着色得0分，阳性细胞比例1%～9%得0.1分，阳性细胞比例10%～49%的0.5分，阳性细胞比例大于50%得1分。最终结果H评分为着色强度评分和阳性细胞比例得分的乘积［6］。

1.3 KRAS基因突变情况检测方法 KRAS基因突变检测试剂盒购自厦门艾德生物医药科技有限公司。首先用FFPE DNA提取试剂盒提取石蜡包埋的原发灶或者转移灶标本的DNA，然后采用Real Time PCR法检测人类KRAS基因的突变，包括12和13密码子上7种热点体细胞的突变，分别为:Gly12Asp、Gly12Ala、Gly12Val、Gly12Ser、Gly12Arg、Gly12Cys、Gly13Asp。

1.4 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计数资料的集中趋势与离散趋势以±s表示。各临床病理参数与CXCL13和CXCR5表达的相关性分析采用四格表χ2或R×C列表χ2分析;组间生存分析数据的比较应用Kaplan-Meier's分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CXCL13及CXCR5表达 CXCL13主要表达于间质细胞，观察A组阳性表达率为36.08%，观察B组47.06%，对照A组0，对照 B组11.63%。CXCL13阳性表达率观察B组＞观察A组＞对照B组＞对照A组，P均＜0.05。CXCR5主要表达于上皮细胞，观察 A组阳性表达率 41.24%，观察 B组49.01%，对照A组0，对照B组9.30%。CXCR5阳性表达率观察B组＞观察A组＞对照B组＞对照A组，P均＜0.05。观察组CXCL13与CXCR5表达水平有相关性(P＜0.05)。

2.2 CXCL13及CXCR5蛋白表达与临床病理参数的关系 观察组CXCL13及CXCR5蛋白表达与TNM分期呈正相关(P＜0.05)，与分化程度呈负相关(P＜0.05)，与患者的性别、年龄、肿瘤大小及肿瘤组织学分类等无明显相关(P均＞0.05)。详见表1。

表1 观察组CXCL13及CXCR5蛋白阳性表达与临床病理参数的关系

2.3 CXCL13及CXCR5蛋白表达与结直肠癌预后的关系 观察B组CXCL13表达阳性者5年无进展中位生存时间(PFS)为(9.0±2.3)个月，阴性者为(12.0±7.3)个月，P ＜0.05;CXCR5表达阳性者5 年PFS为(11.4 ±5.4)个月，阴性者为(25.5 ±9.3)个月，P＜0.05。观察A组CXCL13表达阳性者5年PFS为(25.0 ±11.3)个月，阴性者(37.0 ±16.5)个月，P＜0.05;CXCR5表达阳性者5年PFS为(21.7±4.8)个月，阴性者为(55.0 ±17.5)个月，P ＜0.05。

2.4 CXCL13及CXCR5蛋白表达与KRAS基因突变的关系 观察A组KRAS基因突变型36例(其中CXCL13表达阳性12例、CXCR5表达阳性17例)，野生型61例(其中CXCL13表达阳性23例、CXCR5表达阳性23例)，CXCL13及CXCR5蛋白表达与KRAS基因是否发生突变均有相关性(P均＜0.05)。观察B组KRAS基因突变型20例(其中CXCL13表达阳性16例、CXCR5表达阳性14例)，野生型31例(其中CXCL13表达阳性8例、CXCR5表达阳性11例)，CXCL13及CXCR5蛋白表达与KRAS基因是否发生突变均有相关性(P均＜0.05)。

3 讨论

结直肠癌是我国常见的恶性肿瘤，其发病率仅次于胃癌和食管癌，居肿瘤发病率的第5位，且近年有逐渐增加的趋势［8，9］。结直肠癌的转移常作为评价预后的重要指标，转移的程度对治疗策略的选择也有重要的意义。结直肠癌的转移以淋巴结转移为主，结肠癌在结肠上、旁、中间和终末四组淋巴结均有转移;直肠癌首先转移至直肠旁淋巴结，然后再扩散，浸及直肠及肛周组织［3，10］。近年发现一系列与结直肠癌发生、发展及转移有重要关系的小分子调节蛋白，趋化因子就是其中重要的一类。趋化因子通过与其受体相互作用发挥重要的生物学功能。

趋化因子主要有C、CC、CXC、CX3C四个家族，其主要与机体的免疫系统相关。最早发现其与HIV病毒感染的机制有一定的关系［11，12］。近年研究发现，其与多种肿瘤的进展有一定的关系，尤其是CXCL13及其受体蛋白CXCR5的表达。CXCL13是CXC家族的一种，研究者最先在肝脏和淋巴结中检测到其表达。Burkle等［13］研究发现CXCR5在慢性淋巴细胞白血病病情的进展中发挥重要作用。CXCLl3和CXCR5的表达与HIV感染过程中B细胞机能障碍的形成有关。张岩等［14］检测到其在胸腺瘤合并重症肌无力的发病中发挥重要作用，CXCL13及其受体CXCR5的表达更易引起上述疾病的发生。易诚青等［15］发现CXCL13和CXCR5与成骨活跃程度相关，并表现为明显的时间与位点特征。邹春华等［16］研究发现CXCR5的表达与肺癌组织学类型密切相关。本课题组前期研究发现其与结直肠癌组织学类型和复发有一定关系。

本研究结果显示，CXCL13在结直肠癌淋巴结转移灶中的表达高于原发灶，在正常的结直肠组织中未检测到其表达。CXCL13在转移灶淋巴结中的表达明显高于正常淋巴结。CXCR5的表达与CXCL13具有相似的特征。由此可以看出，CXCL13及其受体蛋白CXCR5可以作为评估结直肠癌发病及转移的新的指标。但是关于CXCL13及CXCR5在结直肠癌发病中的具体作用机制，仍需要进一步研究。通过观察CXCL13及CXCR5的表达与临床病理参数之间的关系，我们发现CXCL13及CXCR5的表达与结直肠癌的TNM分期和肿瘤的分化程度具有相关性。肿瘤的TNM分期越高，越容易检测到CXCR5的表达;肿瘤的分化程度越低，越易检测到CXCL13及CXCR5的表达。后者与曹宝森等［4］研究发现的CXCL13及CXCR5在非小细胞肺癌中的表达特点具有一定的相似性。

结合随访资料分析发现，无论是否有淋巴结的转移，在有CXCL13及其受体蛋白CXCR5表达组中，其无进展生存期均短于CXCL13及CXCR5无表达者。可以看出，CXCL13及其受体蛋白CXCR5的表达，是结直肠癌不良预后的一个标志。这与Razis等［17］研究发现 CXCL13及 CXCR5的表达对 Her2阴性乳腺癌患者预后的影响是一致的，然而对于Her2阳性的乳腺癌患者，CXCL13及CXCR5的表达却是一个有利的预后因子。CXCL13及CXCR5如何与Her2基因发生相互作用以及其具体作用的机制，有待进一步研究。

KRAS基因是RAS基因家族的一种，定位于第12号染色上。在RAS基因家族中，KRAS对人类癌症影响最大，它能控制调控细胞生长的信号通路;其发生异常时，则导致细胞持续生长，并阻止细胞自我毁灭。它参与细胞内的信号传递，若KRAS基因发生突变，该基因永久活化，不能产生正常的RAS蛋白，使细胞内信号传导紊乱，细胞增殖失控而癌变［18～20］。当前研究其与多种肿瘤的发生发展有较为明显的关系，尤其是对结直肠癌的预后有较为明显的关系。在KRAS未发生突变的情况下，使用分子靶向药物帕尼单抗治疗结直肠癌患者取得了较好的治疗效果［21，22］。本研究发现，CXCL13 及其受体蛋白CXCR5的表达与KRAS基因的突变具有一定的相关性，我们推测CXCL13及CXCR5与KRAS基因的信号传递有一点关联，其具体影响机制有待进一步研究。

本研究结果表明，趋化因子CXCL13及CXCR5蛋白在结直肠癌转移灶中的表达高于其原发灶，提示其与结直肠癌的转移有一定相关，其具体作用机制有待进一步探索。CXCL13及CXCR5蛋白表达阳性的结直肠癌患者其无进展生存期明显低于CXCL13及 CXCR5阴性表达患者，提示 CXCL13及CXCR5是结直肠癌患者的不良预后因子，其具体机制有待进一步研究。CXCL13及CXCR5的表达与KRAS基因的突变有一定的相关性，CXCL13及CXCR5表达的患者中KRAS基因突变发生率较高，提示CXCL13及CXCR5可能参与KRAS基因信号的传递，其具体影响机制尚需深入探讨。

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