甘露糖敏感型绿脓杆菌制剂对肝癌细胞增殖的影响

张建波，王莉莉，张媛媛，李文全

(1青州市人民医院，山东青州262500;2益都中心医院)

甘露糖高表达是肿瘤细胞的重要特征之一，目前临床已将甘露糖作为肿瘤治疗的一个重要靶点。甘露糖敏感型绿脓杆菌制剂(PA-MSHA)为一种新型免疫抑制剂，研究发现其能与甘露糖发生特异性结合并作用于肿瘤细胞［1］，对诱导肝癌细胞凋亡和抑制其转移具有明显优势但其对于肝癌细胞增殖及细胞周期的影响报道较少。2013年5～12月，我们观察了PA-MSHA对肝癌细胞增殖的影响，现分析结果并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人肝癌细胞株HepG2、MHCC97L(复旦大学研究所所提供)。DMEM培养基(北京索莱宝科技有限公司提供)，BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海酶联生物科技有限公司提供)，免疫人Cyclin D1、PCNA和CDK2以及p21与p27单克隆抗体(美国 Neomarkers公司提供)，甘露糖敏感型绿脓杆菌制剂(北京万特尔生物制药有限公司提供)，FACSCalibur流式细胞仪器(美国BD公司提供)、FR-200A全自动紫外装置(上海惠亿生物科技有限公司提供)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及干预 选取肝癌细胞株 MHCC97L及HepG2分别于DMEM培养基中37℃、5%CO2条件下培养孵育，每隔3天更换1次培养基;在0.25%胰酶—乙二胺四乙酸消化后予1∶3传代处理［2］。细胞传代过夜、贴壁进入对数生长期后选取96孔板，每个孔板中加入100.0 μL的2 000个细胞。MHCC97L及HepG2均随机分为对照组及观察1组、观察2组和观察3组。对照组不干预，观察1组予1.0×108/mL的PA-MSHA处理，观察2组予2.0×108/mL的PA-MSHA处理，观察3组予2.0×108/mL的PA-MSHA+100 mmol/L的甘露糖处理。

1.2.2 观察项目

1.2.2.1 细胞增殖率 采取 MTT法。HepG2和MHCC97L干预后孵育培养48 h，每孔加入10.0 μL的 CCK-8 溶液;分别于干预1、2、3、4、5、6 h 测定450 nm处吸光度值，计算细胞增殖率［3］。

1.2.2.2 细胞周期 分别取培养后浓度为1.0×105/mL的HepG2和 MHCC97L细胞6.0 mL置于50.0 mL的培养瓶中，待细胞贴壁之后吸出培养液，按1.2.1分组及加药。药物作用72 h后消化收集细胞，离心、洗涤，调整浓度为1.0×106/mL;于-20℃环境下予70.0%乙醇行固定24 h;离心去掉固定液后PBS清洗1次，加入碘化丙啶液50.0 μL，于4℃环境下避光处理340 min。FACSCalibur流式细胞仪器检测、分析细胞周期［4］。

1.2.2.3 细胞相关蛋白表达 HepG2和MHCC97L均先于封闭液室温条件下封闭转移后的PVDF膜1 h，放入杂交袋中，加入一抗稀释，反应1 h后置入4℃冰箱处理24 h;PBST洗涤PVDF膜3次，每次15 min;加入二抗处理30 min，PBST洗涤PVDF膜4次，每次15 min;将PVDF膜置入等量混合ECL中的A、B 液中，孵育 5 min，于暗室中曝光显影观察［5］，测定药物干预前后细胞细胞周期蛋白(CyclinD1)、增殖细胞核抗原(PCNA)和周期蛋白激酶2(CDK2)以及p21与p27表达。

1.3 统计学方法 采用SPSS19.0统计学软件行统计学处理。计量资料采用±s表示，独立样本比较采取t检验，频数之间比较采取χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞增殖率 HepG2和MHCC97L的观察1组、观察2组细胞增殖率均明显低于对照组(P＜0.05)，且呈剂量及时间依赖性(P ＜0.05);观察3组与对照组比较无明显变化。见表1、表2。

表1 MHCC97L细胞干预后不同时间细胞增殖率比较

表2 HepG2细胞干预后不同时间细胞增殖率比较

2.2 细胞周期 HepG2和MHCC97L组细胞周期变化见表3、表4。观察1组、观察2组细胞周期阻滞明显强于对照组，且呈剂量及时间依赖性(P＜0.05);观察3组与对照组比较无明显变化，说明PA-MSHA对肝癌细胞周期有明显的抑制作用。

表3 MHCC97L细胞周期比例(%)

表4 HepG2细胞周期比例(%)

2.3 相关蛋白表达 HepG2和MHCC97L各观察组Cyclin D1、PCNA和CDK2表达均明显低于对照组，p21与p27蛋白表达均明显高于对照组(P均＜0.05)。见图1。

3 讨论

肝癌细胞恶化的过程中经常伴随着比较复杂的细胞表面糖蛋白变化，常见的有甘露糖和唾液酸。相关研究显示，乳腺癌、头颈部癌及肝癌细胞均存在高含量的甘露糖，主要原因为甘露糖不能够有效的在肿瘤细胞中转化［6］。

图1 各组 Cyclin D1、PCNA、CDK2及p21、p27 蛋白表达

研究发现，PA-MSHA对肝癌细胞的增殖和细胞周期均具有明显的抑制作用［7］;而外源性甘露糖能够阻止其抑制作用;进一步说明其细胞的毒作用主要是由甘露糖介导的;研究显示，无论是小剂量还是大剂量PA-MSHA均对肝癌细胞的生长周期和增殖有明显抑制作用［8］。本研究结果显示，HepG2和MHCC97L的观察1组及观察2组PA-MSHA作用后细胞多数停留在G0～G1期和G2～M期，S期的增殖细胞明显减少，且细胞增殖速率也大大降低;而观察3组(PA-MSHA+甘露糖)细胞周期和增殖抑制并不明显。进一步分析，不同肝癌细胞中应用甘露糖均对其具有抑制周期和增增殖的作用;本研究应用PA-MSHA的三组Cyclin D1、PCNA和CDK2表达均明显降低，p21与p27蛋白表达均明显升高。主要是由于Cyclin D1是肝癌细胞G1期向S期转变的正常因子，且是G1期的常见蛋白，由于细胞周期抑制，从而使得Cyclin D1蛋白降低;PCNA和CDK2亦为G1周期中的常见蛋白，由于G1周期被抑制，促使其含量降低。p21与p27均是细胞周期的负向调节因子，由于细胞处于G0～G1期和G2～M期时其含量异常增加，从而抑制Rb蛋白的磷酸化，使得细胞周期阻滞［9］。

综上所述，PA-MSHA对HepG2和MHCC97L增殖均具有抑制作用，其主要作用机制可能为抑制Cyclin D1、PCNA和CDK2表达，促进p21与p27表达。PA-MSHA的应用可为肝癌的治疗提供新方向。

［1］李涛，汤钊猷，周建炜，等.甘露糖敏感性绿脓杆菌制剂诱导肝细胞癌凋亡的机制研究［J］.中华肝胆外科杂志，2011，17(10):838-841.

［2］吕国悦，陈儇，邱伟，等.受体作用蛋白在肝癌细胞对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体诱导凋亡耐受中的作用［J］.中华实验外科杂志，2011，28(10):1649-1652.

［3］Taylor PD，Wilson H，Hillier SG，et al.Effects of inhibition of vascular endothelial growth factor at time of selection on follicular angiogenesis，expansion，development and atresia in the marmoset［J］.Mol Hum Reprod，2007 ，13(10):729-736.

［4］周建炜，黄修燕，居旻杰，等.绿脓杆菌制剂对人肝癌MHCC97L细胞增殖和侵袭能力的影响［J］.中华肝胆外科杂志，2010，16(6):455-459.

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［6］李涛，薛琼，周建玮，等.绿脓杆菌制剂抑制肝细胞肝癌生长转移的实验研究［J］.中华肝胆外科杂志，2009，15(11):848-850.

［7］吕国悦，张强，李航，等.肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体与肝癌细胞凋亡［J］.吉林大学学报(医学版)，2008，34(1):167-170.

［8］Yang G，Chu W，Zhang H，et al.Isolation and identification of mannose-binding proteins and estimation of their abundance in sera fromhepatocellular carcinoma patients［J］.Proteomics，2013，13(5):878-892.

［9］郭忠义，董兆如，智绪亭，等.甘露糖敏感型绿脓杆菌制剂对肝癌细胞周期的作用机制研究［J］.中华肝胆外科杂志，2013，19(6):452-455.