蜂胶黄酮对人结肠癌细胞PDE4D及Gadd45G基因表达的影响

其曼古丽·吐尔洪，布威海丽且木·阿巴拜科日，祖丽比亚·司马义，买热艳木·艾尔肯，阿达莱提·麦麦提，依米提·热合曼

(新疆大学生命科学与技术学院，乌鲁木齐830046)

近年研究发现，蜂胶中含有多种对肿瘤细胞具有抑制作用的活性成分，如黄酮类及黄酮醇类，可阻滞细胞周期和诱导肿瘤细胞凋亡;蜂胶黄酮(PB3A)具有一定的抗氧化活性［1］。磷酸二酯酶 4D(PDE4D)、DNA损伤诱导基因G(Gadd45G)分别是肿瘤生长的下调基因和上调基因，两者在前期研究基因芯片分析中的差异表达倍数为10倍以上。PDE4D基因是环磷酸腺苷(cAMP)特异性PDE，具有促进肿瘤细胞增殖作用［2～4］;Gadd45G 具有抑制肿瘤细胞增殖和促进其凋亡的作用［5］，其表达缺失可致细胞的无限增殖，从而引起肿瘤发生［6］。2008年1月以来，我们观察了PB3A对结肠癌SW480细胞生长的抑制作用及PDE4D、Gadd45G表达的影响，现分析结果，探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 结肠癌SW480细胞购自上海细胞生物学研究所细胞库。RIPA-1640培养基购自Hyclone;胎牛血清购自Gibco;Trizol Reagent购自Invitrogen;cDNA反转录试剂盒购自 Fermentas;PDE4D、Gadd45G及 β-actin引物、SYBR®Premix Ex TaqTMPerfect Real Time和 DEPC购自 TaKaRa公司(大连);辣根酶标记兔抗山羊IgG、PDE4D、Gadd45G、βactin等抗体购自博奥森生物有限公司;protein ladder、BCA蛋白定量试剂盒购自 thermo;蜂胶黄酮PB3A(质量分数≥99%)由依米提·热合曼博士提供。

1.2 细胞培养及分组 结肠癌SW480细胞常规培养与含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中(青霉素100 U/mL，链霉素100 U/mL)，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，隔日传代，取处于对数生长期细胞分为PB3A组和对照组。

1.3 细胞干预及细胞形态学观察 PB3A组予100 μg/mL PB3A干预24 h，对照组不干预;干预24 h倒置显微镜下观察两组细胞形态变化。

1.4 细胞干预及 PDE4D、Gadd45G mRNA表达测定 取两组对数生长期SW480细胞，经2.5 g/L胰蛋白酶消化后，以每孔3×106个细胞接种于6孔培养板培养，20 h后吸除原培养液，PB3A组加入含100 μg/mLPB3A 的RPMI-1640培养液每孔2 mL，对照组加入相同浓度的DMSO。继续培养24 h后收集两组细胞，采用Trizol试剂提取总RNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测完整性，核酸蛋白快速检测仪上检测260、280及230 nm处吸光度，经浓度纯度测定，RNA 纯度 A260/280值均为2.0～1.80，说明纯度好;经1.5%琼脂糖凝胶电泳后，比较28 S和18 S两条核糖体RNA(rRNA)带，显色强度约为2∶1。

1.5 细胞PDE4D及Gadd45GcDNA检测 采用实时荧光定量PCR法。取两组细胞总RNA 0.5 μg，按SYBR Green Real-time PCR试剂盒说明，采用实时荧光定量PCR法合成PDE4D及Gadd45G cDNA。引物序列:β-actin:F:5'-CATCCGTAAAGACCTC TATGCCAAC-3';R:5'-ATGGAGCCACCGATCCACA-3';PDE4D:F:5'-TCAGAGTG GTAAATTGTG TGTGAGA-3';R:5'-GGCAGAATCAACCCATGCTT-3';Gadd45G:F:5'-CGAGTCGGCCAA GTTGATGA-3';R:5'-ACCCGCACGATGTTGATGTC-3'。25 μL 反 应 体系中含 cDNA模板1 μL，SYBR®Premix Ex TaqTM12.5 μL，上游引物 0.6 μL，下游引物 0.6 μL，ddH2O 10.3 μL。PCR 扩增程序:95 ℃ 预变性 3 min;95℃变性10 s，65℃退火30 s，40个循环;72℃延伸45 s，共61个循环，末次延伸72℃、5 min。每次扩增均设标准品组和目的基因组以及2管空白对照组(以ddH2O代替模板)。以β-actin 134 bp作为阳性内参对照，对cDNA模板的细胞拷贝数进行校正。扩增效率为90%～115%。△循环阈值(Ct)=样品 Ct均值 -内参照 Ct均值，ΔΔCT=(CT靶基因-CT内参)PB3A 组 -(CT靶基因-CT内参)对照组;2-ΔΔCT为目的基因的相对总量;2-ΔΔCT＞1表示目的基因表达上调，2-ΔΔCT＜1 表示基因表达下调。

1.6 细胞干预及PDE4D、Gadd45G蛋白检测 采用蛋白免疫印迹法。待培养的细胞以80%汇合状态时，PB3A组用100 μg/mL的 PB3A干预24 h，对照组不干预。将0.25%胰蛋白酶消化的3×106个细胞用冰冷的PBS冲洗2次，加入RIPA细胞裂解液300 μL，孵育 30 min，12 000 r/min 4 ℃ 离心 15 min，取上清，用BCA法定量总蛋白，每孔上样总蛋白量为50 μg。经12%SDS-PAGE分离Gadd45G蛋白，8%SDS-PAGE分离PDE4D蛋白，4℃时将蛋白质分别于90 V、100 V下转到PVDF膜60 min，用含5% 牛血清蛋白封闭液封闭处理60 min，分别加入一抗(1∶2 000稀释的兔抗人Rb单克隆抗体)4℃过夜;用TBST缓冲液充分漂洗后，加入二抗(1∶3 000稀释)室温反应2 h，辣根酶标记兔抗山羊IgG显色，用Image lab(4.0)软件检测两组Gadd45G和PDE4D与内参β-actin蛋白条带的体积。

1.7 统计学方法 应用SPSS16.0软件行统计学处理。组间比较采用t检验。P＜0.01为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞形态变化 PB3A干预后24 h，倒置显微镜下见PB3A组细胞培养液混浊，细胞体缩小、变圆、皱缩，并出现折光性减弱的细胞，细胞内出现颗粒状物质;见图1。对照组无明显变化。

2.2 PDE4D及 Gadd45G mRNA表达 PB3A组PDE4D mRNA表达低于对照组(P＜0.01)，两者差异倍数为0.071;而Gadd45G mRNA表达高于对照组(P ＜0.01)，两者差异倍数为8.11，见图 2。

2.3 PDE4D及 Gadd45G蛋白表达 PB3A组PDE4D蛋白表达低于对照组，Gadd45G蛋白高于对照组(P ＜0.01)，见图3。

图1 PB3A干预24 h后SW480细胞形态学变化(200×)

图2 两组PDE4D及Gadd45GmRNA表达

图3 两组PDE4D及Gadd45G蛋白表达

3 讨论

PB3A类具有抗肿瘤、降血脂和机体免疫调节功能等作用，对人体正常细胞和组织几乎没有毒副作用［7］，对结肠癌细胞具有抑制增殖及诱导凋亡的作用。PDE4D在人前列腺癌组织和细胞中PDE4D呈过度表达，用短发夹RNA(shRNA)敲除PDE4D后在体外和体内可减少前列腺癌细胞的扩散［3］;PDE4D过度表达可促进人肺癌细胞增殖，而PDE4D抑制剂可抑制或沉默PDE4D表达，减少人肺肿瘤细胞的增殖和集落形成［8，9］，表明 PDE4D 是一种肿瘤细胞增殖的促进因子。近期研究表明，用shRNA耗尽内源性PDE4D基因可引起乳腺癌、肺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、胃癌、黑色素瘤细胞增值抑制和凋亡，但是PDE4D的缺失对相邻正常组织和良性肿瘤几乎没有影响［10］;可见PDE4D基因可能是恶性肿瘤的指标基因之一。PB3A可能通过诱导肿瘤细胞增殖的促进因子PDE4D的下调表达而发挥其抗癌活性。

研究发现，Gadd45G基因表达缺失可导致细胞的无限增殖，从而引起肿瘤的形成;相反其过度表达可使减慢体内细胞碱基的摄取速度，抑制细胞形成克隆的能力，从而影响 DNA 的修复［11，12］;脑垂体腺瘤［13］、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、宫颈癌、肺癌和鼻咽癌［14］、胃癌、胰腺癌和结肠癌组织中Gadd45G表达降低，其机制涉及启动子甲基化或转录后修饰的改变［15，16］;Gadd45G 可通过激活 c-Jun氮末端激酶途径而诱导细胞发生凋亡［17］。研究发现，人肝癌细胞株HepG2及结肠癌细胞株SW480中Gadd45G mRNA表达增高。提示PB3A可能通过诱导Gadd45G基因的上调表达而抑制结肠癌细胞增殖并促进凋亡。

本研究发现，PB3A组PDE4D mRNA及蛋白表达水平均低于对照组，Gadd45G mRNA及蛋白表达水平均高于对照组。提示两条基因差异表达可能在结肠癌的发生和发展中起重要作用;PB3A可通过诱导PDE4D和Gadd45G基因表达而抑制SW480细胞生长，诱导其凋亡;但其确切的作用机制尚待进一步研究。

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