siRNA干扰TRIM29基因对人肺癌NCI-H520细胞株增生及迁移能力的影响

刘春晓 李 辉 侯生才 胡 滨 苗劲柏 张文谦

(首都医科大学附属北京朝阳医院胸外科，北京100020)

肺癌已成为当今世界上严重威胁人类健康与生命的恶性肿瘤之一。肺癌的临床治疗包括外科手术、化学治疗、放射治疗及分子靶向治疗等多学科综合治疗。对肺癌发生、发展分子机制的研究能为肺癌的治疗提供新的靶点。TRIM29定位于llq23，是TRIM家族的一员，含锌指基因序列，可能是一种转录调控因子。有研究者［1］发现TRIM29在非小细胞肺癌(non small cell lung cancer，NSCLC)组织中表达有差异，但对其具体作用的研究仍较少。本研究发现，采用RNA干扰技术，抑制TRIM29的表达，可抑制肺癌细胞株NCI-H520的增生和迁移能力。

1 材料与方法

1.1 细胞和主要试剂

人肺癌细胞株(NCI-H520)购自中国医学科学院肿瘤医院细胞库，细胞培养液及血清均为美国Hyclone公司产品。总RNA提取Trizol试剂盒，脂质体Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司。RT-PCR试剂盒购自天根生化科技有限公司。TRIM29引物和内参β-actin引物以及siRNA片段由上海吉玛制药技术有限公司合成。TRIM29抗体购自Cell Signaling Technology公司。MTT试剂和Transwell小室均为美国Sigma公司产品。

1.2 细胞培养及转染

人肺癌NCI-H520细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI-l640培养液中，并置于37℃、CO2体积分数为5%及饱和湿度的温箱中培养。转染前1 d，先将细胞种于6孔板，使其在24 h内到达70% ～80%融合。加药前30～40 min换液，加1 mL基础培养基。配置siRNA 5 μL+250 μL 基础培养基，lipo 2000 5 μL+250 μL培养基基础室温下静置5 min，将上述溶液混匀，静置20 min后将混合液逐滴均匀加入孔板，8 h后观察，必要时换成全培养基，48～72 h后检测。转染siRNA(sense:5'-GAGCUGCGCAAGUCCAUUUTT-3')。转染siRNANC(sense:5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3')组作为阴性对照组，未做任何处理组细胞为空白对照组。

1.3 Real-time PCR 检测

Trizol法提取各实验组NCI-H520细胞的总RNA，紫外分光光度计准确定量。总RNA进行反转录获取cDNA后进行PCR反应。RT-PCR引物TRIM29基因正义链为:5'-GACATCATACCAGCCCTCGT-3';反义链为:5'-ATCCCGTTGCCTTTGTTGAC-3'。β-actin基因引物正义链为:5'-CGTCTTCCCCTCCATCGT-3';反义链为:5'-GAAGGTGTGGTGCCAGATTT-3'。

1.4 Western blotting 分析

细胞转染48 h后，利用RIPA细胞裂解液(购自北京康为世纪生物科技有限公司)提取总蛋白，二辛可酸(bicinchonininc acid，BCA)试剂盒(购自江苏碧云天生物技术有限公司)测定蛋白浓度，并调整待测样本的蛋白质含量。每孔加50 μg的蛋白样品，电泳、转膜、封闭，按1∶200稀释一抗，置4℃冰箱过夜。PBST冲洗膜3次，每次10 min，分别按1∶10 000稀释二抗温育l h，PBST冲洗膜3次，每次10 min。通过Odyssey双色红外荧光成像系统(购自美国Licor公司)读取目的电泳条带的密度值。

1.5 MTT法检测细胞增生

将各组处理后的细胞用胰蛋白酶消化，以5×103个/孔接种于96孔培养板.每组设6个复孔和空白对照。每孔加20 μL MTT(5 mg/mL)培养4 h后，弃上清，再加入二甲基亚砜每孔150 μL，于微量振荡器充分振荡5 min，使结晶物充分溶解。用全自动酶标仪按参比波长为470 nm测定各孔吸光度A值。

1.6 Transwell迁移实验

采用美国Sigma公司的Transwell小室，消化6孔板中已转染的状态良好的NCI-H520细胞，以1×105个/孔接种于6孔培养板内，温育24 h后分别加入含有空白对照或NC control或siRNA的培养基48 h后消化离心，调整细胞密度为4×105/mL，取0.2 mL接种到Transwell小室，并将Transwell小室置于24孔板内，上室内为含1%(质量分数)灭活血清的培养基，下室为含10%(质量分数)灭活血清的培养基。培养24 h后用棉签头擦掉小室内细胞，予90%(体积分数)甲醇固定，0.1%(质量分数)结晶紫染色，洗净风干后于荧光倒置显微镜200倍视野下拍照。实验重复3次。

1.7 统计学方法

采用SPSS 13.0进行统计分析。计量数据以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用t检验或单因素方差分析。采用Graphpad Prism 5.0绘图。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RT-PCR及Western blotting法检测siRNA干扰后TRIM29基因及蛋白的表达

RT-PCR和Western blotting法分析分别检测siRNA干扰TRIM29基因后在基因水平和蛋白水平的表达变化。结果显示:与空白对照组、NC组相比，siRNA处理组NCI-H520细胞的TRIM29的mRNA、蛋白水平的表达量均被显著抑制(图1)。

2.2 siRNA降低TRIM29基因表达抑制NCI-H520细胞增生

MTT法检测细胞增生，结果如图2所示，与空白组及对照组比较，TRIM29 siRNA转染组NCI-H520细胞生长明显减慢。

2.3 siRNA降低TRIM29基因表达抑制NCI-H520细胞的迁移能力

Transwell小室法检测细胞的迁移能力，结果如图3所示:与空白组及对照组比较，TRIM29 siRNA转染组NCI-H520细胞迁移能力明显减弱。

3 讨论

肺癌是目前世界上最常见的恶性肿瘤之一，虽然外科手术切除联合化疗等综合治疗已取得了明显进步，但肺癌患者的生存率仍然不高。为了提高肺癌患者的远期生存率，充分认识肺癌的生物学行为的分子机制具有重要作用。

图1 转染TRIM29 siRNA后NCI-H520细胞中TRIM29 mRNA及蛋白的表达量Fig.1 Specific downregulation of TRIM29 mRNA and protein expression by TRIM29 siRNA

图2 MTT法检测转染siRNA后NCI-H520细胞的增生活性Fig.2 MTT assay used to evaluate NCI-H520 cell proliferation

TRIM29蛋白属于三结构域(tripartite motif，TRIM)蛋白家族，含有一系列保守的锌结合结构域:RING指结构域(R)，1型B-box和/或2型B-box结构域(B1-B2)，coiled-coil结构域(CC)［2］。TRIM29 是近年来逐渐受到关注的具有多种生物学功能的蛋白，其表达有明显的组织和细胞特异性，多种肿瘤细胞表达明显增高［2-4］。最近一项研究［5］表明，与周围正常肺组织相比，TRIM29蛋白在非小细胞肺癌组织中表达增高［1］。本研究利用 RNAi技术，将特异性针对TRIM29基因的siRNA片段转染进入肺癌NCI-H520细胞中，结果，与空白对照组及NC组相比，siRNA处理组TRIM29 mRNA和蛋白表达水平均明显下调。此结果提示，在NCI-H520细胞中，TRIM29siRNA能够有效、特异性地抑制TRIM29的表达。

图3 Transwell迁移实验检测转染siRNA后NCI-H520细胞的迁移能力Fig.3 Transwell assay used to determine the invasion capacity of NCI-H520 cells

近年来对TRIM29的研究发现，在某些肿瘤细胞中，TRIM29的表达与肿瘤细胞的增生及生长有关。Wang等［9］发现TRIM29蛋白可以通过激活Wnt/betacatenin通路促进胰腺癌细胞的增生。Jiang等［10］报道TRIM29蛋白在直肠癌细胞增生过程中起重要作用，干扰TRIM29蛋白的表达，可抑制直肠癌细胞的增生。Yuan等［11］证实TRIM29蛋白可以通过抑制p53的活性来促进肿瘤细胞的增生。本研究使用MTT法检测细胞增生，与空白组及对照组比较，TRIM29 siRNA转染组NCI-H520细胞生长明显减慢。此结果提示，TRIM29可能参与诱导NCI-H520细胞的生长。

最近的一项研究［1］发现，在肺癌组织中，TRIM29的表达与肺癌的分期及淋巴结转移等病理参数密切相关。进一步研究抑制TRIM29的表达对NCI-H520细胞迁移能力的影响，结果显示与空白组及对照组比较，TRIM29 siRNA转染组NCI-H520细胞迁移能力明显减弱。此研究结果提示，TRIM29可能与NCI-H520细胞的迁移及侵袭能力有关。近年来的研究也发现TRIM29可能参与多种肿瘤细胞的迁移与侵袭，Jiang等［10］报道TRIM29的表达与结肠癌细胞的侵袭能力、淋巴结转移及远处转移有关。Kosaka等［3］发现，在胃癌细胞中，增加TRIM29的表达，可提高肿瘤细胞的侵袭能力，并促进肿瘤细胞的淋巴结转移。

综上所述，本研究结果提示，RNAi技术可以有效抑制TRIM29的表达，进而抑制NCI-H520细胞的增生和迁移能力。TRIM29可能成为肺癌治疗的新靶点。

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