苗药生仙汤对马尾损伤大鼠骶髓脑源性神经营养因子蛋白表达干预的研究

张 磊，熊 屹，王泽兰

0 引 言

脑源性神经营养因子(brain derived neurophic factor，BDNF)是神经营养因子家族(neurotrophic factor，NTFs)中的重要成员，在神经元损伤后再生修复和防止神经元凋亡等多方面发挥重要的作用，被视为一种行之有效的神经保护剂［1］。由于BDNF可同时产生于靶组织和神经元自身［2］，其局部营养作用可通过旁分泌或自分泌实现。有研究显示，产生于靶组织的BDNF经轴突末梢摄取，经逆向轴浆运输至神经元胞体，极大地促进了神经元的存活与再生［3］。苗药生仙汤是源于贵州民间治疗各种神经损伤的验方。本研究通过观察马尾神经损伤大鼠苗药生仙汤治疗后骶髓中BDNF表达的变化，进一步揭示苗药生仙汤治疗马尾神经损伤的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 SPF级雌性SD大鼠60只，体重(250±50)g，由长沙市天勤生物技术有限公司提供，生产许可证号:SCXK(湘)2009-0012。饲养条件温度22～25℃，湿度50%，自由喂养，自由饮水。将60只大鼠按随机数字表法分成正常对照组、空白对照组、苗药组和甲钴胺组，每组15只。所有实验组大鼠于相应时间点进行大鼠脊髓损伤功能(Basso-Beattie-Bresnahan，BBB)评分和组织切片取材。

1.2 主要仪器和试剂 恒温摊片烤片机(型号:HI-1220)(德国Leica公司);轮转切片机(型号:RM-2135)(德国Leica公司);生物组织包埋机(型号:YB-6LF)(湖北孝感亚光医用电子技术有限公司);BDNF抗体(武汉博士德生物工程有限公司);(PV-6001)二步法免疫组化试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.3 实验药物 苗药生仙汤煎剂:含仙茅(佳超幼)20 g，淫羊藿(佳莪浠)20 g，生扯拢(佳嘎旅)20 g，阎王刺(布佳菲)15 g，豨莶草 15 g，大血藤 15 g，五加皮 15 g，杜仲 15 g，威灵仙 15 g，伸筋草 15 g，牛膝10 g，土鳖虫10 g，制草乌10 g。常规方法煎煮后，将煎液浓缩至100%浓度，即1 mL煎液中含1 g生药，放4℃冰箱备用(贵阳中医学院第二附属医院药剂科提供);甲钴胺片:0.5 mg/片(卫材(中国)药业有限公司，批号:国药准字H20030812)，溶于500 mL双蒸水中，配制成0.01 mg/mL甲钴胺无菌水混悬液，置4℃冰箱备用。

1.4 动物模型复制 参照Kurt等［4］方法并加以改良，采用神经夹持损伤方式复制马尾神经损伤模型大鼠，具体步骤如下:水合氯醛腹腔注射麻醉;手术区常规消毒铺巾;腰骶部L2-L5范围后正中线切开皮肤，钝性分离暴露L3-L4椎板;蚊氏钳小心咬除椎板，显露马尾组织;血管夹夹持马尾神经5 s，造成损伤;术后逐层缝合。

1.5 治疗方法 各组大鼠均在造模后第1天开始干预。苗药组和甲钴胺组每天分别予苗药生仙汤煎剂17.55 mL/kg和甲钴胺溶液0.135 mg/kg(给药剂量根据人与大鼠体表面积比，按70kg标准成人等效剂量折算［5］)灌胃1次，直至处死;空白对照组每天予0.9%等渗盐水10 mL/kg灌胃1次;正常对照组不做任何处理。

1.6 指标检测

1.6.1 BBB评分评估神经功能恢复情况 采用BBB评分法评估大鼠神经功能恢复情况，主要观察大鼠活动时双下肢的活动度和范围、协调性及承重情况等。所有大鼠于评分前辅助排空膀胱，放置于光滑地面上自由行走共10 min。

1.6.2 HE染色观察骶髓组织学改变 骶髓组织采用常规石蜡包埋，3 μm厚连续切片，HE染色，观察各组大鼠骶髓组织学改变。

1.6.3 免疫组化检测BDNF蛋白表达 切片脱蜡至水;3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶;EDTA缓冲液(pH 8.0)高压抗原修复;BDNF抗体1∶120稀释，置于湿盒4℃冰箱过夜;山羊抗兔IgG抗体37℃孵育30 min;DAB显色，苏木精复染。用PBS代替一抗作为阴性对照。

1.6.4 结果判定 BBB评分值共分成22个等级，满分为21分表示能完全自如运动，0分表示完全瘫痪。由熟悉评分规则的非实验人员4人各组独立完成评分，取4人评分平均值为最终BBB评分值。光镜下观察骶髓组织标本HE染色和免疫组化染色结果。免疫组化染色以细胞质出现棕黄色染色者判定为BDNF阳性细胞，每张切片随机采集5处视野，病理图像分析系统测定其平均光密度(mean optical density，MOD)值。

1.7 统计学分析 采用SPSS 18.0软件进行统计分析。所有定量数据以均数±标准差(±s)表示。如数据符合正态分布，方差齐，多组数据采用ANOVA分析，组间两两比较采用SNK法;如不符合正态分布，或方差不齐，多组数据采用秩和检验，组间两两比较采用Nemenyi法。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 BBB评分结果 正常对照组大鼠麻醉苏醒后，双后肢功能逐渐恢复，造模后第1天恢复至术前水平;空白对照组、苗药组和甲钴胺组大鼠造模后第1天评分值差异无统计学意义(P＞0.05);造模后第7、14天，苗药组和甲钴胺组评分值明显高于空白对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)，苗药组和甲钴胺组之间评分值差异无统计学意义(P＞0.05);空白对照组、苗药组和甲钴胺组造模后第1、7、14天评分值均呈上升趋势，组内两两比较的差异有统计学意义(P ＜0.05)。见表1。

2.2 HE染色结果 与正常对照组比较，空白对照组大鼠骶髓结构破坏明显，胶质细胞增生显著，随造模后时间推移，神经元胞体退变加重，最终出现崩解、固缩，尼氏体消失，有较大液化空洞出现;苗药组和甲钴胺组大鼠骶髓破坏较轻，胶质细胞增生也明显改善，正常神经元数量较多。见图1。

2.3 免疫组化染色结果 造模后第1天，空白对照组、苗药组、甲钴胺组阳性染色细胞数高于正常对照组;造模后第7、14天，苗药组和甲钴胺组阳性染色细胞数多于空白对照组，见图2。造模后第1天，空白对照组、苗药组和甲钴胺组MOD值均明显高于正常对照组(P＜0.05)，其中，甲钴胺组MOD值明显高于苗药组和空白对照组(P＜0.05)，造模后第7、14天，苗药组和甲钴胺组MOD值明显高于空白对照组(P＜0.05);空白对照组、苗药组和甲钴胺组MOD值随时间推移均呈先升后降趋势，苗药组和甲钴胺组组内两两比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，空白对照组造模后第14天时MOD值明显低于造模后第7天(P＜0.05)，但与造模后第1天比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表2。

表1 各组大鼠不同时间点BBB评分值比较(±s，n=5)Table 1 Comparison of BBB scale of each group at different time points(±s，n=5)

表1 各组大鼠不同时间点BBB评分值比较(±s，n=5)Table 1 Comparison of BBB scale of each group at different time points(±s，n=5)

与空白对照组同时间点比较，*P＜0.05;空白对照组、苗药组、甲钴胺组组内两两比较，P＜0.05

时 间大鼠BBB评分正常对照组 空白对照组 苗药组 甲钴胺组造模后第1天 21.00±0.00*11.60 ±1.14 11.40 ±1.14 11.40 ±0.89造模后第7 天 21.00 ±0.00* 14.00 ±0.70 17.00 ±1.00* 16.20 ±0.84*造模后第14 天 21.00 ±0.00* 16.40 ±0.55 19.60 ±0.55* 18.80 ±0.84*

图1 各组大鼠不同时间点骶髓组织结构变化(HE×400)Figure 1 The sacral spinal cord of each group at different time points(HE×400)

图2 各组大鼠不同时间点骶髓组织(免疫组化染色 ×400)Figure 2 The sacral spinal cord of each group at different time points(immunohistochemistry staining×400)

表2 各组大鼠不同时间点MOD值比较(±s，n=5)Table 2 Comparison of MOD value of each group at different time point(±s，n=5)

表2 各组大鼠不同时间点MOD值比较(±s，n=5)Table 2 Comparison of MOD value of each group at different time point(±s，n=5)

与正常对照组比较，*P＜0.05;与空白对照组和苗药组比较，#P＜0.05;苗药组、甲钴胺组造模后3个时间两两比较，P＜0.05

损伤时间组别正常对照组 空白对照组 苗药组 甲钴胺组造模后第1 天 0.130 ±0.006 0.152 ±0.007* 0.156 ±0.008* 0.162 ±0.008*#造模后第7 天 0.130 ±0.006 0.181 ±0.007* 0.205 ±0.009* 0.217 ±0.033*造模后第14 天 0.130 ±0.008 0.161 ±0.014* 0.183 ±0.008* 0.187 ±0.007*

3 讨 论

马尾损伤临床上较为常见，多继发于各种原因引起的椎管狭窄。由于马尾表面缺乏结缔组织保护，仅有一层神经内膜，因而在生理上易受到机械性压迫而出现损伤［6］。此外，马尾所在的硬膜内外血管鲜有交通支［7］，极易发生缺血。

BDNF是神经营养因子家族(neurotrophic factor，NTFs)中的重要成员，1982年由Barde首次从猪脑提取液中获得［8］。神经元损伤后，损伤局部微环境的改善与周围小胶质细胞密切相关，BDNF正是由激活的小胶质细胞分泌产生［9］。当神经元轴突发生变性时，局部 BDNF mRNA含量显著上升［10］。BDNF通过与高亲和力酪氨酸激酶受体结合，激活包括 MAPK/ERK、PLCr和 PI3K等多条信号通路，进而参与促进神经元发育、分化和再生过程。BDNF广泛分布于中枢和周围神经系统，而包括其在内的NTFs不仅能促进损伤处周围神经的修复与再生，还能保护脊髓中枢神经元，促进其存活，防止发生凋亡或坏死［11-12］。马尾神经损伤后，由逆向轴浆运输至脊髓神经元胞体的BDNF大幅减少，这是脊髓神经元胞体发生形态和功能改变的重要原因。临床上已有鼠神经生长因子等相关药物开始使用。然而，BDNF等NTFs成员分子量均较大，难以通过血脑、血脊髓屏障［13］。且该类药物价格昂贵，限制了其在临床的广泛应用。苗医药近年来得到了长足的发展，苗药以其独特的理论体系和奇特的疗效，正被越来越多的人所认识［14］。

苗药生仙汤是源于贵州民间治疗神经损伤的验方，具有祛风通络，补益肝肾，强筋壮骨等功效，临床应用多年，疗效明确。方中仙茅(佳超幼)、淫羊藿(佳莪浠)、五加皮、杜仲补肝肾、强筋骨、壮腰膝，祛风湿，为君。臣以阎王刺(布佳菲)、大血藤、威灵仙、伸筋草、制草乌、土鳖虫等祛风除湿，疏通经络;佐以豨莶草、生扯拢(佳嘎旅)制约诸药之辛热，兼奏活血通络之功;牛膝引药下行，为使。全方标本兼顾，祛湿除痹而不伤正，使经络得以疏通，气血通行无阻，治疗神经损伤后气血瘀滞，筋脉失养颇为适宜。

本研究通过BBB评分对疗效的综合评价，从神经运动功能方面衡量苗药生仙汤对马尾神经损伤的恢复情况，并选择了具有神经组织营养作用的甲钴胺作为阳性对照组，以明确苗药生仙汤营养神经，促进修复的作用。研究中发现，马尾神经损伤后，骶髓组织自身长期处于BDNF低表达状态，周围局部微环境持续恶化，这可能是马尾神经和骶髓组织发生变性坏死的原因之一。苗药生仙汤干预第7天后，苗药组大鼠骶髓组织BDNF表达比第1天时明显增高且明显高于同时间对照组;但干预第14天后，BDNF的表达又有所下降，但仍高于干预后第1天，可见BDNF表达峰值出现在干预后第7天左右。而甲钴胺组和苗药组大鼠骶髓组织中BDNF水平在药物干预后第7天和第14天差异并无统计学意义，说明两者均能上调BDNF的表达。结合HE染色结果不难发现，BDNF的表达水平与骶髓组织损伤程度有联系，高水平表达对骶髓神经元胞体的存活有极大的促进作用。

苗药生仙汤能上调马尾损伤大鼠骶髓中BDNF的表达，这可能是该方促进马尾损伤大鼠受损神经元的修复、再生及保护作用的机制之一。

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