红细胞生成素对高糖诱导人肾小管上皮细胞转分化的影响及其可能机制

陈艳霞，秦晓华，房向东，黄 翀，涂卫平

0 引 言

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病全身微血管病变的一部分，是糖尿病的严重慢性并发症，已成为终末期肾病的重要原因。既往认为DN的主要病变部位在肾小球，但近年来的研究发现高血糖对肾小管间质损害方面发挥了更加重要的作用，高糖可介导间充质转分化(epithelial mesenchymal transition，EMT)的发生，最终促进肾间质纤维化的发生［1］。Rho激酶(ROCK)抑制剂 Y27632和法舒地尔阻断糖尿病鼠的RhoA/ROCK通路后可改善肾小球的通透性［2］、改善肾血流动力学［3］、改善代谢指标及延缓肾小球硬化进展［4］、抑制活性氧自由基的形成［5］和减少细胞外基质蛋白的沉积［6］。这些都意味着RhoA/ROCK信号通路在DN的发生发展过程中发挥重要的作用。促红细胞生成素(Erythropoietin，EPO)可抑制猪近端肾小管上皮细胞转分化，阻止慢性肾疾病的进展［7］，对肾损伤具有保护作用［8］，可显著减轻大鼠体外循环肾损伤［9］，因此本实验选取高糖诱导人肾小管上皮细胞(human kidney cells，HK-2)细胞模拟 DN，并探讨EPO对高糖诱导的HK-2细胞转分化的作用，为延缓肾纤维化的进展寻找新的证据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 EPO(沈阳三生惠赠)，DMEM/F12培养基(美国 Hyclone)，0.25%胰蛋白酶(美国Gibco)，高糖、甘露醇、ROCK抑制剂Y27632(美国Sigma)，RNA抽提试剂 Trizol(美国 Invitrogen)，RT-PCR试剂盒(美国 Fermentas)，2×EasyTaq PCR SuperMix(北京全式金)，聚合酶链反应引物由Invitrogen合成，鼠抗人单克隆平滑肌肌动蛋白(smooth muscle actin-α，α-SMA)抗体、鼠抗人单克隆E-cadherin抗体、FITC标记抗小鼠IgG(北京中杉金桥)，人FN定量酶联检测试剂盒(上海森雄)。

1.2 主要仪器 核酸微量蛋白测定仪、PCR扩增仪、凝胶图像成像系统(美国Bio-Rad)，DYPC-31DN型电泳仪(北京市六一仪器厂)，荧光显微镜(日本Olym-pus)，酶标仪(美国Thermo公司)。

1.3 HK-2细胞培养及实验分组 HK-2细胞株来源于美国ATCC细胞库，由中山大学附属第一医院余学清教授惠赠。用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基在37℃、5%CO2培养箱中培养HK-2细胞，细胞生长至70%～80%融合时传代入6孔培养板中继续培养，至80%融合后改用无血清DMEM/F12培养基同步24h。按随机数字表法进行实验分组:空白对照组、高糖诱导组(高糖终浓度30 mmol/L)、甘露醇对照组(甘露醇浓度24.5 mmol/L)、EPO对照组(EPO终浓度为20 U/mL)、5 U/mL EPO干预组、10 U/mL EPO干预组、20 U/mL EPO干预组(干预组均含高糖30 mmol/L)、ROCK抑制剂(Y27632)组(Y27632终浓度为 30 μmol/L，加入 Y27632 30 min后加高糖，高糖终浓度为30 mmol/L)，以上各组均培养24 h。实验重复3次。

1.4 RT-PCR检测 干预后培养24 h，收集细胞，用Trizol分别提取各组细胞总的RNA，检测RNA完整性后用核酸微量蛋白测定仪测定RNA的浓度。取总 RNA 1.5 μg进行逆转录反应合成cDNA，取cDNA 2 μL在2×EasyTaq PCR SuperMix的作用下扩增目标基因(以人β-actin为内参照)，总反应体系50 μL。RhoA的引物序列:正义链5'-GGCTGGACTCGGATTCGTTG-3'，反 义 链 5'-CGTTGGGACAGAAATGCTTGAC-3'，扩增产物356bp。ROCK1 的引物序列:正义链5'-TGATGGCTATTATGGACGAG-3'，反义链5'-GGAGCGTTTCCCAAGC-3'，扩增产物293 bp。β-actin的引物序列:正义链5'-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3'，反义链 5'-TGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'，扩增产物434 bp。反应条件:94℃ 预变性5 min，55℃退火30 s，72℃延伸7 min，共35个循环。配制2%琼脂糖凝胶，PCR产物电泳仪内120 V，30 min完成电泳后应用凝胶成像系统成像并使用Quantity One软件进行数据分析。

1.5 细胞免疫荧光 6孔培养板中的细胞在4℃下用4%多聚甲醛固定20 min，用0.1%Triton穿孔15 min，5%牛血清白蛋白(BSA)封闭液室温封闭30 min后各孔中滴加鼠抗人单克隆α-SMA抗体(抗体按1∶200稀释，5%BSA封闭液配制)或鼠抗人单克隆E-钙黏蛋白抗体4℃冰箱孵育过夜后取出室温恢复30 min，加入FITC标记抗小鼠IgG二抗置37℃孵箱孵育30 min，荧光显微镜下观察。每组细胞选取10个视野摄像，荧光图片用Image-Pro Plus 6.0软件分析，每个视野累计光密度值与测量面积的比值为平均荧光强度(即蛋白相对表达量)。

1.6 ELISA法检测纤连蛋白(fibronectin，FN)收集细胞上清液后严格按ELISA试剂盒说明进行操作，读取波长为450 nm时的A值，绘制标准曲线，根据标准曲线方程求出样品FN表达浓度。

1.7 统计学分析 应用SPSS 17.0软件进行统计分析，计量资料用均数±标准差(±s)表示，多组均数比较用单因素方差分析，两两组间比较用LSD法，若方差不齐用秩和检验。变量间的比较采用Pearson直线相关分析，以 P≤0.05为有统计学意义。

2 结 果

2.1 高糖、EPO 对 RhoAmRNA、ROCK1 mRNA表达的影响 高糖诱导组RhoA mRNA及ROCK1 mRNA的表达较空白对照组明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，EPO干预组 RhoA mRNA 及ROCK1 mRNA较空白对照组的表达显著减少，差异有统计学意义(P＜0.05)，且与EPO浓度呈现一定的相关性。见表1、图1。

2.2 RhoA mRNA与ROCK1 mRNA相关性分析直线相关分析显示高糖诱导组，5、10、20 U/mL EPO干预组RhoA mRNA与ROCK1 mRNA呈正相关(r=0.907，P=0.046，r=0.899，P=0.041;r=0.862，P=0.021;r=0.832，P=0.007)。

2.3 高糖、EPO对α-SMA、E-钙黏蛋白及FN的蛋白表达影响 空白对照组弱表达α-SMA，高表达E-钙黏蛋白;高糖诱导组α-SMA表达较空白对照组显著上升(P＜0.05)，E-钙黏蛋白表达较空白对照组显著下降(P＜0.05);EPO干预组及ROCK抑制剂组E-钙黏蛋白的蛋白表达较高糖诱导组明显增加，而α-SMA表达明显下降(P＜0.05)，并且随EPO浓度的升高作用下降更加显著。ELISA结果显示EPO干预组及ROCK抑制剂组FN表达较高糖诱导组显著下降(P＜0.05)，且下降程度与EPO浓度相关。见表2。

图1 各组细胞RhoAmRNA及ROCK1 mRNA的表达情况Figure 1 The mRNA expressions of RhoA and ROCK1 in different groups

表1 各组细胞RhoA mRNA及ROCK1 mRNA的相对表达水平(±s)Table 1 The mRNA expressions of RhoA and ROCK1 in different groups(±s)

表1 各组细胞RhoA mRNA及ROCK1 mRNA的相对表达水平(±s)Table 1 The mRNA expressions of RhoA and ROCK1 in different groups(±s)

与空白对照组比较，*P＜0.05;与高糖诱导组比较，#P＜0.05;与5 U/mL EPO干预组比较，△P＜0.05;与10 U/mL EPO干预组比较，▲P ＜0.05

组别 n 0.945 ±0.131 51.007 ±0.002高糖诱导组 3 1.400 ±0.022*# 1.913 ±0.011*#甘露醇对照组 3 0.952 ±0.004 1.003 ±0.002 EPO 对照组 3 0.945 ±0.011 1.004 ±0.002 5 U/mL EPO 干预组 3 0.278 ±0.006*# 1.418 ±0.006*#10 U/mL EPO干预组 3 0.770 ±0.005*#△ 0.919 ±0.004*#△20 U/mL EPO干预组 3 0.334 ±0.009*#△▲ 0.477 ±0.002*#△▲ROCK 抑制剂组 3 1.390±0.002*#△ 0.249±0.005*#△▲RhoA mRNA ROCK1 mRNA空白对照组3

表2 各组细胞α-SMA、E-钙黏蛋白、FN的蛋白表达水平(±s)Table 2 The expressions of α-SMA，E-cadherin，FN in different groups(±s)

表2 各组细胞α-SMA、E-钙黏蛋白、FN的蛋白表达水平(±s)Table 2 The expressions of α-SMA，E-cadherin，FN in different groups(±s)

与空白对照组比较，*P＜0.05;与10 U/mL EPO干预组比较，#P＜0.05;与高糖诱导组比较，△P＜0.05;与5 U/mL EPO干预组比较，▲P ＜0.05

组别 n α-SMA E-钙黏蛋白 FN(ng/mL)0.224 ±0.006 0.644 ±0.006 2582.50 ±87.20高糖诱导组 3 0.335 ±0.006* 0.107 ±0.004* 14545.53 ±317.27*甘露醇对照组 3 0.223 ±0.082 0.645 ±0.006 2434.63 ±198.76 EPO 对照组 3 0.225 ±0.006 0.645 ±0.008 2512.97 ±205.27 5 U/mL EPO 干预组 3 0.285±0.005＊△ 0.236±0.006＊△▲ 11273.73±597.17＊△▲10 U/mL EPO干预组 3 0.273±0.007＊△▲ 0.433±0.010＊△▲ 6690.70±380.76＊△▲20 U/mL EPO干预组 3 0.243±0.006*#△▲ 0.521±0.010*#△▲ 5252.70 ±179.23*#△▲ROCK 抑制剂组 3 0.235±0.006*#△▲ 0.357±0.006*#△▲ 3252.13±197.08*#△▲空白对照组3

3 讨 论

传统观念认为，DN是由于血流动力学及代谢因素引起的，现在越来越多的证据支持，慢性微炎症状态及免疫系统的激活也是DN的发病机制之一［10］。EPO是一种多功能的细胞因子，不仅具有促进红细胞生成的作用，同时还有抗凋亡［11］及免疫调节作用［12］。对实验性自身免疫性脑脊髓炎模型的研究发现，EPO还具有抗炎的作用［13］。在DN中，高糖主要是通过刺激某些细胞因子产生和促进细胞外基质合成而发挥效应，进而发生EMT。EMT的主要特点是具有上皮细胞标志的E-钙黏蛋白丢失和间充质特征的α-SMA、间质基质组分如FN的表达。Patel等［14］也证实在 EMT过程中，Rho的激活是一个关键性的步骤。Brownlee等［15］提出细胞对葡萄糖-诱导毒性的敏感性依赖于其吸收机制及高糖环境下的调节能力。然而肾小管上皮细胞无法减少葡萄糖转运从而减少细胞在高糖环境下发生的形态及功能的改变。肾小管上皮细胞吸收葡萄糖是不受胰岛素水平调节的，因此，在高糖环境下，肾小管上皮细胞对葡萄糖水平更敏感。本实验以高糖培养HK-2细胞模拟DN模型，探讨红细胞生成素对高糖诱导人肾小管上皮细胞转分化的影响。本研究证实高糖可通过RhoA/ROCK信号通路引起肾小管上皮细胞转分化，给予RhoA/ROCK信号通路抑制剂Y27632后肾纤维化指标发生显著改变，高糖诱导组荧光结果显示E-钙黏蛋白表达显著下降，α-SMA的蛋白表达显著上升，ELISA结果亦提示细胞外基质的主要成分FN的蛋白表达明显增多，我们的研究表明，高糖可诱导 HK-2细胞发生 EMT并激活RhoA/ROCK信号通路，RhoA/ROCK通路参与高糖诱导的EMT，与Gu等［16］研究结果一致。给予EPO干预后，E-钙黏蛋白表达相对增多，α-SMA的蛋白表达相对减少，FN表达相对减少，说明给予EPO干预后减轻了EMT过程，从而显示出EPO对高糖诱导的肾小管上皮细胞转分化过程具有保护作用。Person直线相关分析显示高糖诱导组及EPO干预组RhoA mRNA与ROCK1 mRNA呈正相关，推测其保护作用与RhoA/ROCK通路有关。因本实验显示，给予高糖刺激后，RhoA mRNA及ROCK mRNA的表达明显增强，加入EPO干预后，其表达随EPO浓度的增加而逐渐减弱。EPO通过RhoA/ROCK通路发挥保护作用的具体机制有待进一步研究，可能与EPO的抗炎及免疫调节作用有关。

本实验证实了EPO可抑制高糖诱导的HK-2细胞的转分化，从而延缓肾间质纤维化的进程，为DN患者的治疗带来新的希望。然而目前国内外研究对DN患者EPO延缓肾纤维化作用在临床上使用的量及使用时间等问题均未有明确的观点。EPO的潜在毒性作用如高血压、充血性心力衰竭、血栓甚至可能阻滞肿瘤细胞的凋亡等也限制其在临床的使用［17］。相信随着EPO研究的不断深入，EPO对DN患者的治疗作用指日可待。

［1］ Lee JH，Kim JH，Kim JS，et al.AMP-activated protein kinase inhibits TGF-β-，angiotensin II-，aldosterone-，high glucose-，and albumin-induced epithelial-mesenchymal transition［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2013，304(6):686-697.

［2］ Axelsson J，Rippe A，Rippe B.Acute hyperglycemia induces rapid，reversible increases in glomerular permeability in nondiabetic rats［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2010，298(6):1306-1312.

［3］ Komers R，Oyama TT，Beard DR，et al.Effects of systemic inhibition of Rho kinase on blood pressure and renal haemodynamics in diabetic rats［J］.Br J Pharmacol，2011，162(1):163-174.

［4］ Kikuchi Y，Yamada M，Imakiire T，et al.A Rho-kinase inhibitor，fasudil，prevents development of diabetes and nephropathy in insulin-resistant diabetic rats［J］.J Endocrinol，2007，192(3):595-603.

［5］ Gojo A，Utsunomiya K，Taniguchi K，et al.The Rho-kinase inhibitor，fasudil，attenuates diabetic nephropathy in streptozotocin-induced diabetic rats［J］.Eur J Pharmacd，2007，568(1):242-247.

［6］ Kolavennu V，Zeng L，Peng H，et al.Targeting of RhoA/ROCK signaling ameliorates progression of diabetic nephropathy independent of glucose control［J］.Diabetes，2008，57(3):714-723.

［7］ Chen CL，Chou KJ，Lee PT，et al.Erythropoietin suppresses epithelial to mesenchymal transition and intercepts Smad signal transduction through a MEK-dependent mechanism in pig kidney(LLC-PK1)cell lines［J］.Exp Cell Res，2010，316(7):1109-1118.

［8］ Lin X，Jiang C，Luo Z，et al.Protective effect of Erythropoietin on renal injury induced in rats by four weeks of exhaustive exercise［J］.BMC Nephrol，2013，14:130.

［9］ 王高明，刘灿辉，黄海嵘，等.促红细胞生成素减轻大鼠体外循环肾损伤的实验研究［J］.医学研究生学报，2012，25(5):466-470.

［10］ Navarro-Gonzalez JF，Mora-Fernandez C，de Fuentes MM，et al.Inflammatory molecules and pathways in the pathogenesis of diabetic nephropathy［J］.Nat Rev Nephrol，2011，7(6):327-340.

［11］ 张 华，赵日红，刘漫君.重组人促红细胞生成素对高氧肺损伤新生大鼠细胞凋亡及蛋白激酶B表达的影响［J］.医学研究生学报，2013，26(5):469-472.

［12］ Nairz M，Sonnweber T，Schroll A，et al.The pleiotropic effects of erythropoietin in infection and inflammation［J］.Microbes Infect，2012，14(3):238-246.

［13］ Zhang X，Li QY，Xiao BG.Anti-inflammatory effect of erythropoietin therapy on experimental autoimmune encephalomyelitis［J］.Int J Neurosci，2011，122(5):255-262.

［14］ Patel S，Takagi KI，Suzuki J，et al.RhoGTPase activation is a key step in renal epithelial mesenchymal transdifferentiation［J］.J Am Soc Nephrol，2005，16(7):1977-1984.

［15］ Brownlee M.The pathobiology of diabetic complications a unifying mechanism［J］.Diabetes，2005，54(6):1615-1625.

［16］ Gu L，Gao Q，Ni L，et al.Fasudil inhibits epithelial-myofibroblast transdifferentiation of human renal tubular epithelial HK-2 cells induced by high glucose［J］.Chem Pharm Bull(Tokyo)，2012，61(7):688-694.

［17］ Maiese K，Chong ZZ，Shang YC.Raves and risks for erythropoietin［J］.Cytokine Growth Factor Rev，2008，19(2):145-155.