陕北地区马铃薯卷叶病毒的RT—PCR检测与序列分析

2014-12-02冯光惠杜虎平李夏隆亢福仁

湖北农业科学 2014年19期

冯光惠+杜虎平+李夏隆+亢福仁

摘要：以陕北8个县（区）种植2～3代疑似带毒的马铃薯叶片为材料，用Trizol法提取马铃薯叶片总RNA，以已公布的马铃薯卷叶病毒外壳蛋白（CP）基因序列设计特异引物，通过RT-PCR扩增目的DNA片段，对CP基因进行克隆和测序，采用DNAstar软件分析序列的一致性。结果表明，从陕北8个县（区）马铃薯叶片中均扩增到与预期大小一致、长度为336 bp的目的片段，说明马铃薯均感染了卷叶病毒。陕北8个县（区）马铃薯卷叶病毒CP基因之间的序列一致性达99.6%以上，与国内外其他地区10个样品CP基因的序列一致性为96.2%～99.8%，表明马铃薯卷叶病毒的CP基因序列比较保守。

关键词：马铃薯卷叶病毒；CP基因；RT-PCR检测；序列分析

中图分类号：S435.32 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）19-4734-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.19.060

RT-PCR Detection and CP Gene Sequence Analysis of Potato Leaf Roll Virus in Northern Shaanxi Province

FENG Guang-hui，DU Hu-ping，LI Xia-long，KANG Fu-ren

（College of Life Science，Yulin University， Yulin 719000，Shaanxi，China）

Abstract： Taking 2-3 generations of suspected poisonous potato leaf planted in eight counties （districts） of Northern Shaanxi province as materials， the total RNA was extracted from potato leaves by Trizol method. Specific primers were published coat protein（CP） gene sequence of potato leaf roll virus. The DNA fragment was amplified by RT-PCR. Then the CP gene was cloned and sequenced. Sequence identity was analyzed by DNAstar software. The results showed that the gene sequence amplified from potato leaves from 8 counties in Northern Shaanxi area were consistent with the expected size with length of 336 bp. These potatoes were all infected with potato leaf roll virus. The CP gene sequence identity between potato leaf roll virus in 8 counties （districts） of Northern Shaanxi was more than 99.6%. 10 samples of CP gene sequences from other regions at home and abroad had identity ranged from 96.2% to 99.8%. It is indicated that the CP gene of potato leaf roll virus is more conservative.

Key words： potato leaf roll virus； CP gene； RT-PCR detection； sequence analysis

马铃薯卷叶病毒（Potato leaf roll virus，PLRV）是马铃薯主要的病毒之一，分布于世界各地马铃薯种植区。卷叶病毒可通过种薯、蚜虫或嫁接传播，感染卷叶病毒会造成马铃薯减产30%～90%[1]。近年来，脱毒马铃薯在全国各地大面积推广，但随着脱毒种薯种植代（年）数的增加，病毒在植株体内不断积累和传播，导致马铃薯产量和品质逐渐下降，而且还会感染其他种类的病毒和类病毒。因此，及时、准确地检测田间种植马铃薯的带毒情况，采用茎尖分生组织培养脱毒法、热处理法、抗病毒药剂法等[2]脱毒技术控制病毒的蔓延，可为脱毒马铃薯的推广种植奠定基础。

检测马铃薯病毒常用的方法有双抗体夹心酶联免疫吸附法（DAS-ELISA）、反转录PCR法（RT-PCR）和实时荧光定量PCR法。DAS-ELISA法操作简单、实用性强，准确度较高，但检测病毒含量较低的马铃薯时，灵敏度和准确度不高，会出现假阴性现象。RT-PCR检测技术在病毒含量极低时也可以快速检测马铃薯病毒，该方法具有灵敏、快速、准确度高、特异性强等优点，适用于马铃薯[3]、葡萄[4]等其他植物病毒的检测。在RT-PCR检测技术基础上，研究者应用多重RT-PCR对马铃薯多种病毒同时进行检测[5-7]。随着实时荧光定量PCR技术的发展，Bright等[8]利用该方法检测了马铃薯PVX、PVY、PVA和PLRV 4种病毒；Sheila等[9]采用该方法检测了PVX、PVS、TSWV和PLRV 4种病毒。多重RT-PCR和实时荧光定量PCR方法大大提高了马铃薯病毒的检测效率，并逐渐应用到其他植物、动物病毒以及微生物的检测上，但多重RT-PCR和荧光定量PCR方法易出现假阴性现象[10，11]。国内研究者采用RT-PCR方法检测了不同地区的马铃薯卷叶病毒[12-14]，但尚未见用RT-PCR法检测和分析陕北地区马铃薯卷叶病毒的报道。因此，本试验以陕北8个县（区）种植2～3代的疑似带毒马铃薯为研究对象，采用RT-PCR方法检测该地区的马铃薯卷叶病毒，并对马铃薯卷叶病毒的外壳蛋白（Coat protein，CP）基因序列进行分析，从而掌握病毒的变异程度，以期为脱毒马铃薯的种薯繁育和推广种植提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品的采集于2013年7-10月在马铃薯生长盛期至成熟期，采集马铃薯疑似带病毒植株叶片，常温下保存于保湿组织培养瓶中，4 ℃冰箱保存。供试马铃薯的具体情况见表1。

1.1.2 仪器与试剂主要仪器有PCR仪（朗基，杭州朗基科学仪器有限公司）、电泳仪、分光光度计、凝胶成像系统（Bio-rad，美国伯乐生命医学产品上海有限公司）。Trizol试剂、cDNA合成试剂盒、DNA胶回收试剂盒、pGEM-Teasy载体、Taq DNA聚合酶、dNTP、10×buffer均购自北京全式金生物科技有限公司。

1.1.3 引物设计根据GenBank数据库中登录的马铃薯卷叶病毒CP基因序列，利用引物设计软件Primer 5设计1对特异引物，上游引物为5′-CGCGCTAACAGAGTTCAGCC-3′，下游引物为5′-GCAATGGGGGTCCAACTCAT-3′。预期扩增片段长度为336 bp，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，将其用灭菌TE（pH 8.0）稀释至浓度为10 μmol/L。

1.2 方法

1.2.1 马铃薯卷叶病毒的RT-PCR检测

1）马铃薯总RNA的提取。采用Trizol法参照文献[15]的方法进行，略做改动。称取0.1 g马铃薯叶片在研钵中用液氮研磨，取1.5 mL离心管加入1 mL Trizol，将研磨液与Trizol溶液混合均匀；4 ℃、12 000 r/min离心15 min；转移上清液至另一离心管中，加入0.2 mL氯仿，涡旋混匀，室温放置5 min，4 ℃、12 000 r/min离心15 min；取上清液（水相）于另一离心管中，按上清液体积分别加入1/2体积的异戊醇、0.8 mol/L柠檬酸钠和1.2 mol/L氯化钠，混合均匀，室温放置5～10 min，4 ℃、12 000 r/min离心8 min，弃上清液，用1 mL 75%乙醇洗涤沉淀2次，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，小心倒掉乙醇，室温自然干燥后溶于用DEPC处理过的ddH2O，于-80 ℃条件下保存。

2）cDNA的合成。按照cDNA合成试剂盒说明书操作，对提取的马铃薯叶片总RNA进行反转录。具体反应体系如下：马铃薯总RNA 5 μL，Anchored Oligo（dT）18（0.5 μg/μL） 1 μL，2×ES Reaction Mix 10 μL，EasyScript RT Enzyme Mix 1 μL，加RNase-free Water至20 μL。混匀后，水浴锅中42 ℃孵育30 min，PCR仪中85 ℃条件下加热失活5 min。

3）PCR反应及产物检测。PCR反应体系：cDNA 3 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，10×buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，Taq DNA聚合酶1 μL，加ddH2O至50 μL。PCR反应程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 10 min。取6 μL PCR扩增产物与1 μL Loading Buffer混匀，用15 g/L琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，于凝胶成像系统中照相。

1.2.2 CP基因的克隆及序列分析用DNA胶回收试剂盒回收纯化PCR产物，将其与pGEM-Teasy载体连接过夜，转化大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞，在加有IPTG和X-gal的LB平板上筛选白色菌落，于LB液体培养基中培养，采用碱裂解法提取质粒，采用EcoRⅠ和Hind Ⅲ限制性内切酶对重组质粒进行鉴定。将含目的条带的阳性重组质粒送南京金斯瑞生物科技有限公司测序。用DNAstar软件分析CP基因的序列相似性，并与GenBank中搜索的国内外10个不同地区的马铃薯卷叶病毒CP基因（表2）进行序列相似性分析。

2 结果与分析

2.1 马铃薯卷叶病毒CP基因的RT-PCR检测

对采自陕北8个县（区）马铃薯叶片所含病毒CP基因的RT-PCR产物进行检测，结果如图1所示，这8个样品均能扩增出预期长度为336 bp的目的条带，表明8个采样点的马铃薯植株均感染了卷叶病毒。

2.2 马铃薯卷叶病毒CP基因的序列一致性分析

用DNAstar软件对马铃薯卷叶病毒CP基因序列进行分析，结果表明，陕北8个县（区）卷叶病毒 CP基因之间的一致性达到99.6%以上，序列之间变异率很低。以榆阳区马合镇的马铃薯卷叶病毒CP基因为对照（CK），与国内外其他地区10个马铃薯样品CP基因的序列一致性为96.2%～99.8%（表3），表明马铃薯卷叶病毒的CP基因序列比较保守，不易发生变异。

3 讨论

本研究调查发现，陕北8个县（区）最近几年都在推广种植脱毒马铃薯，但一级脱毒种薯种植2～3年后，马铃薯叶片开始出现卷曲、小叶、花叶、皱缩等症状，薯块性状发生变化，产量也呈下降趋势，说明马铃薯卷叶病毒等单一病毒或各种复合病毒感染了马铃薯。可能是对马铃薯脱毒苗及各级种薯的检验、检疫、监督不够严或者蚜虫通过汁液传播使马铃薯感染病毒。

RT-PCR分子检测技术可快速、准确地检测马铃薯的带毒情况，是近年来国内外应用较为普遍的病毒检测技术。在普通RT-PCR体系中，只要提取的马铃薯总RNA质量高，在检测不同种类的病毒和类病毒时，设计不同的特异引物，就能扩增出预期的目的条带，不会发生假阴性现象，检测效果好。另外，在用RT-PCR检测常见的6种病毒PVX、PVY、PVS、PVA、PVM和PLRV以及类病毒PSTVd时，可通过改变PCR反应体系中的温度，实现多种病毒的同步检测。

通过克隆测序，可了解马铃薯病毒的变异程度。马铃薯不同病毒的变异也有差异，本试验研究表明，陕北8县（区）马铃薯卷叶病毒CP基因序列的一致性在99.6%以上，而同地区马铃薯X病毒CP基因序列的一致性却在95.2%～99.4%。病毒变异率高低以及不同病毒变异率差异大小对马铃薯的产量和品种有何影响，有待进一步研究。

参考文献：

[1] 路平，王蒂，司怀军.马铃薯卷叶病毒的RT-PCR快速检测[J].甘肃农业大学学报，2005，40（4）：532-534.

[2] 李凤云.马铃薯茎尖脱毒效果影响因素的研究[J].中国马铃薯，2008，22（4）：201-204.

[3] 吴兴泉，时妍，杨庆东，等.马铃薯病毒的RT-PCR检测技术评述[J].中国马铃薯，2011，25（4）：251-254.

[4] 王建辉，刘建军，陈克玲，等.三种葡萄病毒的RT-PCR检测和系统进化分析[J].果树学报，2013，30（2）：197-201.

[5] NIE X，SINGH R P. A novel usage of random primers for multiplex RT-PCR detection of virus and viroid in aphids，leaves，and tubers[J]. Journal of Virological Methods，2001，91（1）：37-49.

[6] 王中康，夏玉先，袁青，等.马铃薯种苗复合感染病毒多重RT-PCR同步快速检测[J].植物病理学报，2005，35（2）：109-115.

[7] 董代幸，张祥林，罗明，等.马铃薯病毒一步法多重RT-PCR检测技术的构建[J].微生物学通报，2011，38（1）：131-137.

[8] BRIGHT O A，PATRICK J S，PHILIP H B. Simultaneous dection of potato viruses，PLRV，PVA，PVX and PVY from dormant potato tubers by TanMan real-time RT-PCR[J].Journal of Virological Methods，2007，142（1-2）：1-9.

[9] SHEILA M M，MICHAEL G K，ROGER A C. A single tube，quantitative real-time RT-PCR assay that detects four potato viruses simultaneously[J]. Journal of Virological Methods，2009，161（2）：289-296.

[10] GAMBINO G，GNBAUDO I.Simultaneous detection of nine grapevine viruses by multiplex RT-PCR with coamplification of a plant RNA as internal control[J].Virology，2006，96（11）：1223-1229.

[11] 牛建新，马兵钢，何梅，等.库尔勒香梨主要病毒多重RT-PCR检测技术研究[J].植物病理学报，2006，36（1）：12-21.

[12] 丁铭，方琦，李婷婷，等.马铃薯卷叶病毒云南分离物外壳蛋白基因的克隆与序列分析[J]. 植物病理学报，2006，36（5）：473-476.

[13] 吴兴泉，谭晓荣，陈士华，等.马铃薯卷叶病毒福建分离物的基因克隆与序列分析[J].河南农业大学学报，2006，40（4）：391-393.

[14] 周云，杨永智，王舰.青海省马铃薯卷叶病毒的RT-PCR法检测[J].西北农业学报，2007，16（6）：210-211.

[15] COURTNEY E J，AMY O C，DAVID K W. Evaluation of isolation methods and RNA integrity for bacterial RNA quantitation[J]. Journal of Microbiological Methods，2008，75（2）：318-324.