黄花蒿新品种选育现状及其系统选育研究进展

马进+向极钎+杨永康+龙澜+李红英+覃大吉+李亚杰+向来

摘要：青蒿素及其衍生物被世界卫生组织和FDA列为抗疟疾一线药，而目前青蒿素只能从黄花蒿（Artemisia annua L.）中提取。育成的高含量青蒿素单株其优良性状不能稳定遗传，后代性状分离，表现多样化。介绍了国内外对黄花蒿品种的选育途径及现状。通过2010-2013年4年系统选育，已育成一批好苗头株系，株系群体青蒿素含量由选育前平均含量0.471%提高到0.800%～0.972%，生物学特征特性也趋于稳定一致，并在黄花蒿原料基地小面积示范得到验证，同时选育出青蒿素高含量株系40#-30-08-18，青蒿素含量高达1.945%，取得了阶段性育种成果。

关键词：黄花蒿（Artemisia annua L.）；青蒿素；育种现状；目标性状；系统选育

中图分类号：S567.21；S333.6 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）19-4520-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.19.003

Current Situation of Breeding and Progress of Systematic Breeding of

New Varieties of Artemisia annua

MA Jin1，2，3， XIANG Ji-qian1，2， YANG Yong-kang2，3， LONG Lan2，3， LI Hong-ying2，3，

QIN Da-ji2，3， LI Ya-jie2，3， XIANG Lai4

（1.Hubei Provincial Agricultural Science and Technology Innovation Center，Enshi 445000， Hubei， China； 2. Institute of Horticulture and Drugs， Enshi Autonomous Prefecture Academy of Agricultural Sciences Enshi 445000， Hubei， China； 3.Enshi Qingjiang Biological Engineering Co.， Ltd.，Enshi 445000， Hubei， China； 4.Enshi City Sancha Township Agricultural Center，Enshi 445019， Hubei， China）

Abstract： Artemisinin and its derivatives are designated by WHO and FDA as the first line and effective drug for treating malaria， while they can only be extracted from Artemisia annua currently. The excellent characters of Artemisia annua plants selected with high levels of artemisinin can not inherit stably. The properties of offspring separate with diverdity. The current situation of breeding of Artemisia annua at home and abroad was briefly described. Authors got some breeding lines by pedigree selection from 2010 to 2013. The average artemisinin content of the breeding lines increased from 0.471% to 0.800%～0.972%. The biological characteristics were tended to be stable and consistent. The artemisinin content of one breeding line 40#-30-08-18 was high upto 1.945%.

Key words：Artemisia annua L.； artemisinin； breeding status； target trait； system selection

疟疾严重影响人类健康，据世界卫生组织报告，全球有107个国家和地区、32亿人口受到疟疾传播的威胁，每年造成超过65万人死亡，严重影响人类健康，发病区域主要在非洲、东南亚等国家。20世纪70年代我国科技工作者首次从黄花蒿中分离出抗疟疾单体青蒿素，为抗疟疾特效药。从20世纪80年代中期起，研究者们对青蒿素的结构进行研究并加以改造，先后成功合成青蒿素的衍生物：青蒿琥酯、蒿甲醚、双氢青蒿素3个新药，它们的抗疟药效要远远优于以往抗疟药奎宁、氯喹等传统抗疟药而跃升为未来的主流药物，同时对血吸虫病、艾滋病并发症等也有很好的疗效。它是迄今为止中国惟一被世界卫生组织（WHO）认可的按西药标准开发的中药，是中国仅有两个收入世界药典的中药之一，被世界卫生组织指定为“世界上惟一有效的疟疾治疗药物”[1]。

1 黄花蒿概述

黄花蒿（Artemisia annua L.）又名臭蒿，臭青蒿，草蒿子，为菊科（Asteraceae）蒿属（Artemisia）一年生草本植物。黄花蒿系世界性广布种，从中提取的青蒿素是一种含有过氧化桥的倍半菇内酷，无色针状晶体，熔点156～157 ℃，分子式C12H22O5，是一种与已知抗疟药完全不同类型的新型化合物。但其青蒿素含量随产地不同差异极大，除我国少数地区的黄花蒿外，世界大多数地区的黄花蒿的青蒿素含量都很低，一般为0.200%以下[2]。在我国，黄花蒿的青蒿素含量由南到北逐渐降低。例如，广西、厦门、四川酉阳、湖南、湖北、江苏高邮、山东、陕西、内蒙古的黄花蒿的青蒿素含量分别达1.200%、1.200%、0.980%、0.790%、0.680%、0.190%、0.097%、0.215%、0.170%[2-9]，尤其是生长在川东南、鄂西、湘西及黔东北武陵山区的黄花蒿的青蒿素含量普遍较高[2]。在国外，以越南的黄花蒿的青蒿素含量较高，其叶中青蒿素含量可达0.860%[10]。印度一些地区的黄花蒿的青蒿素含量在叶中可高达0.420%[11]，其他国家和地区的黄花蒿的青蒿素含量一般在0.200%。

从天然黄花蒿中提取青蒿素是目前获取青蒿素的惟一来源。当前栽培的黄花蒿由野生黄花蒿直接引种，产量低，尤其是青蒿素含量低（0.500%以下）。由于遗传差异，单株之间青蒿素含量差异特别大（0.200%～1.945%）。目前国内大多数青蒿素生产企业的青蒿素提取率在0.300%～0.350%，提取率低的主要原因是黄花蒿原料青蒿素含量低（0.500%～0.600%），其次是提取工艺水平落后。2005-2006年青蒿素卖价高达4 500～5 500元/kg，生产企业利润非常丰厚，从2007年起行情逐年下滑，至2013年市场价跌至2 000元/kg以下。而在当前劳动力成本急剧上涨的情况下，青蒿素的生产成本在2 600元/kg左右，生产企业出现严重亏损，众多生产企业倒闭，给国家及银行造成巨大经济损失。

现存的青蒿素生产企业，要想重振昔日雄风，除在现行医药流通环节打通症结外，关键是要收购青蒿素含量高的原料和提高青蒿素的提取率，帮助企业扭亏为盈。据生产青蒿素的老牌企业恩施清江生物工程有限公司成本核算，在黄花蒿原料青蒿素含量0.600%和提取工艺及有机溶剂、辅料、劳动力等成本不变的情况下，原料青蒿素含量每提高0.100%将为企业增收25%以上。

2 黄花蒿的栽培育种研究现状

黄花蒿生活力强，野生资源丰富，但近年来由于需求量增大，主要依靠人工栽培种植，从20世纪70年代开始，研究者们着手黄花蒿的引种和驯化工作，他们对黄花蒿的生物学特性、栽培条件、生活习性、生长发育规律等方面进行了研究，为黄花蒿栽培提供了科学依据。青蒿素在黄花蒿中储存部位的研究尚没有肯定的答案，现在普遍认为黄花蒿叶及花中存在的腺毛状分泌腺[12]T-型网状分泌腺[13]是青蒿素合成和储存的位点。

目前普遍认为黄花蒿是一种严格的短日照植物，未成年的植株对光周期信号很敏感，光处理两周就会开花[14]。黄花蒿抗逆性强[15]，在栽培条件下，只要黄花蒿的基本营养得到满足，就能正常生长发育，开花，结子，种子繁殖能力强，栽培植株生长比野生植株好，青蒿素含量也明显高于当地野生种[5，6，16，17]。微量元素硼[18]能提高青蒿素含量，外施生长调节物质[19]能够促进植株长高和青蒿素含量提高。而收获前水胁迫两周会导致青蒿素含量大幅降低[20]。张萍等[16]认为黄花蒿具有种子驯化现象，经过多年种植后，青蒿素含量明显升高。提前播种移栽能提高产量和青蒿素含量[21，22]。研究者们对青蒿素含量达最高点时黄花蒿的生长时期进行了许多研究，结论不一[14，23]，但均集中在营养生长末期至开花期这段时期，综合考虑生物量和青蒿素含量，一般的收获时间是在花芽分化期[5，6，24]。青蒿素含量最高值出现在晴好天气的12：00-16：00[24，25]。

目前国内还没有真正意义上的黄花蒿品种[3]，因为育成一个高产、高含量青蒿素单株，其后代的遗传性状不稳定，性状分离且表现多样化。近年来，人们在高含量黄花蒿品种选育上做了一些基础性工作。①Ferreira等[26]在温室和田间条件下对青蒿素产生的广义遗传性状进行分析，发现青蒿素含量的高低是由遗传性状决定的。②Wallaart等[27]利用秋水仙素诱导出四倍体黄花蒿，发现四倍体植株青蒿素含量比二倍体植株高38%，叶片比二倍体大得多，但植株矮小，产量低。③Magalhaes等[28]报道黄花蒿杂交种青蒿素产量可增加5 kg/hm2。④Sangwan等[29]利用分子标记，发现不同基因型黄花蒿之间存在较高的多态性，揭示了植株化学物质的差异源于遗传性状的多态性。⑤朱卫平[30]对高青蒿素含量黄花蒿栽培品种选育目标性状进行了较深入的研究，发现通过优中选优的方法可以使青蒿素含量逐年提高；而且研究了叶的形态与青蒿素含量的相关性，发现狭裂片型叶比宽裂片型叶的青蒿素含量要高；此外还对黄花蒿叶的结构进行了显微观察及青蒿素的组织化学定位，发现叶片中的毛状分泌腺是青蒿素的储存部位，其浓度与含量呈正相关。⑥有研究者利用青蒿素代谢工程育成高含量青蒿素的青蒿品种，并在产业上有重大突破。

目前，国内外改造黄花蒿的遗传工作仍然进展缓慢，原因是其代谢复杂，遗传机制不甚明了。

3 黄花蒿新品种系统选育研究方法及进展

2009年湖北的恩施清江生物工程有限公司与恩施自治州农业科学院药物园艺研究所联合组织了黄花蒿高产、高青蒿素含量品种选育工作，课题组将釆用系统选育法（优中选优法）用7～8年时间育成一批单产超3 000 kg/hm2、青蒿素含量大于1.000%且稳定的一批株系，用于恩施清江生物工程有限公司基地生产黄花蒿原料。通过2010-2013年4年时间对所栽培的黄花蒿进行系统选育，课题组已育成一批好苗头株系，植株形态及特征特性也趋于一致，取得了阶段性成果，现报告如下。

3.1 黄花蒿繁殖生物学特征特性

黄花蒿一般采用种子繁殖[31]，种子千粒重为0.03～0.04 g，且种子无休眠期，可随采随播，幼苗抗寒性较强，在恩施自治州一般年份都能安全越冬。生长阶段：6-7月中旬为营养生长盛期，8月上旬为花芽分化，9月上旬至下旬为现蕾期，9月下旬至10月上旬为开花期，10月上旬至11月上旬为谢花期，11月中旬至12月上旬为种子成熟期。种子成熟期很不一致，光照条件好的先成熟，荫蔽的下部后成熟。

花为头状花序，花序细小球形，具软细短梗；许多无柄小花密集着生于花序轴的顶部，聚成头状，再由许多头状花序组成伞房花序。花为风媒花，异花授粉且自花不实。

3.2 确定选育目标性状

1）育成的株系植株属于丰产型，要求茎秆粗壮，株高1.6～2.4 m，一级分枝多，中下部二级分枝多，上部二级分枝少；叶为狭裂丝状裂片型，茎秆和叶片颜色偏黄。

2）育成的株系青蒿原料单产超3 000 kg/hm2且青蒿素含量稳定大于1.000%的一批株系。

3.3 选育步骤及方法

3.3.1 黄花蒿试验苗定植 2010年4月10日从黄花蒿苗圃中选取长势旺盛、根系发达且无病虫危害的壮苗，按1.0 m×1.5 m的密度定植于恩施市三岔乡小井口试验田（海拔842 m），肥水及病虫防治等田间管理与青蒿原料基地相同。

3.3.2 黄花蒿挂牌、取样 挂牌的黄花蒿植株必须符合目标性状，要求茎秆粗壮，株高1.6～2.4 m，一级分枝多，中下部二级分枝多，上部二级分枝少；叶为狭裂丝状裂片型，茎秆和叶片颜色偏黄。编号采用1#、2#、3#等表示。

先编号挂牌然后取样，取样时间定于每年8月10日左右，晴天12：00-16：00（花芽分化期）。方法是取植株上、中、下部枝各一枝装入网袋中，置于玻璃温室内干燥，干燥后将叶和幼嫩茎搓成粉末状装入塑料自封袋备检测。

3.3.3 样品检测

1）检测前处理。称取青蒿样品2 g，用中性滤纸折叠封严浸泡于80 mL 30～60 ℃石油醚中8 h，然后用索氏提取器循环用石油醚提取4 h（石油醚量不足时应随时添加保证循环），加热浴锅温度至52 ℃左右。提取液用旋转蒸发器将石油醚分离，然后再用22 mL无水甲醇分3～4次将瓶内提取物借用超声波振荡溶解洗出盛入25 mL容量瓶中，并定容至25 mL刻度。滴定管再移取5 mL至50 mL容量瓶中，加0.2%氢氧化钠溶液20 mL，50 ℃反应30 min，冷却，加0.08 mol/mL醋酸至50 mL刻度。

2）检测。化学反应制成溶剂样品用高效液相色谱仪测出峰面积，计算出青蒿素含量。标样釆用中国药检所制成的青蒿素标样。

3.3.4 株系隔离 根据检测结果，高青蒿素含量单株保留，低含量和未检测的单株要在黄花蒿开花之前彻底清除，并做好试验田以外的隔离工作，防止生物学混杂。

3.3.5 种子采收 11月中旬以后，种子开始成熟，当种子颜色腊黄色时，分单株采收，严防株系间种子机械混杂，晾干搓柔，种子分筛入袋保存。

3.4 选育结果

通过4年的系统选育，从表1可以看出，2010年挂牌检测的50个单株中，青蒿素最低含量为0.212%，最高含量为40# 1.119%，群体内单株平均含量0.471%；2013年40#-53-02株系内26株检测结果，单株最低含量提高至0.579%，最高含量提高至1.605%，群体内单株平均含量提高至0.972%，其原因是通过逐年选育，较高含量单株在株系整体中所占比例增加，平均含量也在逐年提高和逐年稳定。其他各株系的各项含量均有显著提高。

3.5 青蒿素高含量株系在大田栽培示范的测产和检测结果

2013年对青蒿素高含量39#-20-11、39#-20-13、40#-30-08、40#-53-02、39#-20-09、40#-30-0909株系种子育苗，按1 m×1 m密度小面积示范栽培，田间肥水等管理与系统选育试验田同步实施，其产量及青蒿素含量检测结果如表2所示。

从2013年恩施清江生物工程有限公司自控基地黄花蒿原料入库数据来看，一般单产1 800-2 250 kg/hm2，青蒿素含量0.500%～0.600%。从表2可以看出，系统选育出的高青蒿素含量株系后代群体单产均超过2 700 kg/hm2，其中有两个株系突破3 000 kg/hm2；青蒿素含量均超0.800%，其中有两个株系突破0.930%。所选育出的青蒿素高含量株系，无论在产量上还是在青蒿素含量上，均在大田小面积示范栽培得到验证，证明课题组确定的选育目标性状是科学的，取得了阶段性选育成果。

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