EphA4在人上皮性卵巢癌中的表达及临床意义*

王玉楼，张静艳，温秋婷△

(1．齐齐哈尔医学院第一附属医院普外一科，黑龙江齐齐哈尔161042;2．齐齐哈尔医学院临床病理诊断中心，黑龙江齐齐哈尔161006)

卵巢癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，发病率呈逐年增高的趋势，且发病年龄有年轻化的倾向［1］。卵巢癌的发病和进展隐匿，往往在确诊时已为晚期，因此寻找更好的与预后有关的分子标志物及治疗靶点显得尤为重要。生促红素肝细胞受体激酶(Erythropoietin producing hepatocellular carcinoma cell line，Eph)是酪氨酸蛋白激酶受体(receptor tyrosine kinases，PTKs)家族中的最大的分支，有研究显示Eph家族蛋白与肿瘤的发生和肿瘤血管的形成有关［2-3］。本研究采用免疫组化法检测E-phA4蛋白，用原位杂交检测EphA4mRNA在卵巢肿瘤中的表达，并分析其与卵巢癌的生物学行为之间的关系。

1 材料和方法

1．1 材料

收集我院病理科2006年1月至2011年12月存档的原发性卵巢癌根治术手术标本84例，常规石蜡包埋。患者年龄32～76岁，平均年龄51．4岁±6．9岁。淋巴结转移者52例，无转移者32例。临床分期:Ⅰ期10例、Ⅱ期6例、Ⅲ期51例、Ⅳ期17例。病理学分级:高分化17例，中分化26例，低分化41例。病理类型:浆液性腺癌51例、粘液性腺癌28例、内膜样腺癌5例。以20例卵巢良性肿瘤(卵巢浆液性囊腺瘤及粘液性囊腺瘤)作为对照组。

1．2 EphA4蛋白的检测

免疫组织化学SP法，EphA4兔抗人多克隆抗体购自天津赛尔生物公司，工作液浓度为1:100，SP免疫组化试剂盒购自北京中杉公司，PBS代替一抗作为阴性对照，严格按说明书进行操作。

1．3 EphA4mRNA 的检测

非放射性地高辛标记cDNA为探针进行原位杂交实验，原位杂交试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。实验所用玻璃器皿均经180℃烘烤8h，以消除RNA酶。杂交过程:组织切片常规二甲苯脱蜡，系列酒精复水，3%H2O2室温10min，3%柠檬酸稀释的胃蛋白酶室温消化30min。每张切片滴加20μL预杂交液，将湿盒置于37℃恒温箱中孵育4h。每片滴加20μL杂交液，38℃～42℃恒温箱过夜。杂交后用预热的SSC洗涤，37℃封闭30min。滴加生物素化鼠抗地高辛于37℃作用60min，加入SABC 37℃作用20min，滴加生物素化过氧化物酶37℃作用20min，DAB显色，苏木素复染。

1．4 结果判定

原位杂交及免疫组化染色均用DAB显色，二者均以出现棕黄色颗粒为阳性染色。每例各观察两张切片，避开肿瘤边缘和坏死区各随机计数10个高倍视野，结果以染色强度和阳性细胞的百分数来判定:细胞未见棕黄色颗粒或阳性细胞数＜10%为阴性“-”，着色浅或阳性细胞数占11%～25%记“+”，着色深黄或阳性细胞数占26%～50%记“++”，着色为棕色或阳性细胞数＞50%记“+++”［4］。

1．5 统计学方法

采用 SPSS19．0统计软件，EphA4蛋白和 E-phA4mRNA在卵巢肿瘤中阳性表达率的比较，E-phA4蛋白和EphA4mRNA的表达与卵巢癌的临床病理特征的关系采用卡方检验，P＜0．05具有统计学意义。

2 结果

2．1 EphA4蛋白在卵巢肿瘤组织中的表达情况

免疫组化检测结果，EphA4的表达主要位于细胞浆和细胞膜(图1)，在卵巢癌中的阳性表达率为78．57%(66/84);而20例良性卵巢病变中，阳性率为25．0%(5/20)，且均为弱表达，两者比较差异有统计学意义(χ2=21．401，P ＜0．01)(表1)。

图1 EphA4蛋白在卵巢良性肿瘤和卵巢癌中的表达(×400)Figure 1 EphA4 protein expression in benign ovarian tumor and epithelial ovarian cancerA:Benign ovarian tumor;B:Well differentiated epithelial ovarian cancer;C:Poor differentiated epithelial ovarian cancer

表1 EphA4在卵巢癌和卵巢良性肿瘤组织中的表达Table 1 EphA4 protein expression in epithelial ovarian cancer and benign ovarian tumor

卵巢癌中EphA4的阳性表达率78．57%(66/84)明显高于卵巢良性肿瘤中的表达率25．0%(5/20)(χ2=21．401，P ＜0．01)。

2．2 EphA4蛋白阳性表达和临床病理资料的关系

EphA4蛋白的表达在卵巢癌组织学分级，临床分期和淋巴结转移在分组比较中差异具有统计学意义(P＜0．01)。晚期卵巢癌(Ⅲ+Ⅳ期)的阳性表达率86．76%明显高于早中期卵巢癌(Ⅰ+Ⅱ期)的阳性表达率 43．75%(P ＜0．01);有淋巴结转移组88．46%明显高于无淋巴结转移组62．50%(P＜0．01);随着卵巢癌病理分级的升高，EphA4蛋白的表达逐渐增加，中低分化卵巢癌的阳性表达率85．07%高于高分化卵巢癌的阳性表达率52．94%(P ＜0．05)。见表2。

表2 EphA4蛋白表达与上皮性卵巢癌临床病理特征之间的关系Table 2 The relationship between EphA4 protein expression and clinicopathological characteristics in epithelial ovarian cancer

2．3 EphA4mRNA在卵巢肿瘤组织中的表达情况

EphA4mRNA的阳性信号主要位于胞浆。良性卵巢肿瘤、高分化卵巢癌、低分化卵巢癌的阳性率分别为 19．43%、47．06%、86．57%，差异有显著的统计学意义(P＜0．01)。EphA4mRNA的表达与临床病理资料的关系，在卵巢癌的组织学分级，临床分期和淋巴结转移的分组比较中有统计学意义(P＜0．05)，而与患者的年龄，组织学分型及有无腹水无明显相关性(P ＞0．05)。

表3 EphA4mRNA的表达与上皮性卵巢癌临床病理特征之间的关系Table 3 The relationship between EphA4mRNA expression and clinicopathological characteristics in epithelial ovarian cancer

图2 EphA4mRNA在卵巢良性肿瘤和卵巢癌中的表达(×400)Figure 2 EphA4 mRNA expression in in benign ovarian tumor and epithelial ovarian cancerA:Benign ovarian tumor;B:Well differentiated epithelial ovarian cancer;C:Poor differentiated epithelial ovarian cancer

3 讨论

细胞信号传导途径在肿瘤的发生发展过程中机制的研究，是目前肿瘤研究的热点。信号传导通路中各蛋白质的磷酸化和去磷酸化是信号转导的最重要调控方式之一，负责这一修饰调节的是蛋白激酶与蛋白磷酸酶。生促红素肝细胞受体激酶(Eph)及其配体ephrin是酪氨酸激酶受体家族(RTKs)中最大的亚家族，根据Eph亚族各成员的同源性，表达分布以及结合配体的不同，可将其分为EphA和EphB亚型，相应的配体也有两个亚型ephrinA和ephrinB，EphA4受体既可与ephrinA类配体结合，还可与ephrinB2和ephrinB3结合［5］。

EphA4/ephrin作用体系，通常以较低的水平表达于成人各种上皮细胞中，能够潜在激活双向信号传导通路和细胞效应，分别充当“受体”和“配体”两个角色，参与调节细胞的增生、迁移、变形和粘附等，还参与调节轴突导向、突触形成等神经发育过程。近年来发现其在肿瘤演进过程中也有重要作用，可能参与调节肿瘤细胞的生长、粘附、变形及血管生成等过程，影响肿瘤的进展和转移，而且还可能与肿瘤的血管生成有关［6］。

研究发现EphA/ephrin在许多肿瘤组织中的表达明显高于相应正常组织，提示EphA/ephrin可能与肿瘤的许多恶性生物学行为相关，如肿瘤的侵袭性和转移能力增强，并可能参与促进肿瘤血管形成［7］。以往的研究发现在人类前列腺癌和胰腺癌组织中，有EphA4受体的高表达［8］;EphA4受体的高表达与胃癌的进展和转移相关［9-12］。本研究在转录和翻译水平检测EphA4基因和EphA4蛋白在卵巢肿瘤中的表达，结果显示EphA4mRNA及E-phA4蛋白在卵巢癌中的表达明显高于卵巢良性肿瘤(P＜0．01)。EphA4蛋白和EphA4mRNA的表达在卵巢癌的组织学分级，临床分期和淋巴结转移的分组比较中差异具有统计学意义(P＜0．05)，而与患者的年龄、组织学分型及有无腹水等无明显相关性(P＞0．05)。EphA4蛋白在晚期卵巢癌(Ⅲ+Ⅳ期)的阳性表达率86．76%明显高于早中期卵巢癌(Ⅰ +Ⅱ期)的阳性表达率 43．75%(P ＜0．01)，并且随着卵巢癌分化程度的降低，EphA4的表达逐渐增加，差异有统计学意义(P＜0．01)。一些研究表明，将EphA4基因转染至胰腺癌细胞系后，高表达的EphA4受体使癌细胞的生长速度变快［8］，如将EphA4的siRNA转染至胰腺癌细胞后，可以大大降低胰腺癌细胞的生存能力，提示Eph基因可能成为肿瘤生物治疗的靶点［13］。并且EphA4/ephrin还可能通过血管生成因子和血管生成素促使肿瘤血管的大量产生［14］，为肿瘤的生长提供所需营养，同时也为肿瘤的转移开辟了潜在的途径。

综上所述，EphA4在卵巢癌的发生发展中发挥着重要的作用，其作用机制尚不完全明确。进一步研究EphA4在卵巢癌中的作用机制有助于探索卵巢癌治疗更有效的分子靶点。同时进一步明确E-phA4基因对卵巢癌患者预后的影响，有助于对预后较差的卵巢癌患者亚群进行更加积极的干预措施。

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