hTERC和高危HPV及细胞学联合检测在宫颈癌筛查中的价值

柳晓春，邓凯贤，郑玉华，彭 敏，周东华，谢庆煌，潘淑芬

(广东省佛山市妇幼保健院，广东佛山528000)

在世界范围内，浸润性子宫颈癌(Invasional Cervical Cancer，ICC)是严重威胁妇女健康的主要恶性肿瘤之一，早期筛查和治疗是其治疗的重点。在过去的几十年里，中国广泛地开展了宫颈癌筛查工作，使子宫颈癌病死率有所下降，但每年仍然有约12万新发病例［1］。目前，宫颈细胞学检查和(或)HPV病毒检测已较成熟地运用于宫颈癌及癌前病变的筛查并取得了良好效果，但其应用有一定的局限性，亟待探索更为有效的筛查方案，重点在发现和预测高级别宫颈上皮内瘤样变(CIN)。近年来人端粒酶RNA基因(human telomerase RNA gene，hTERC)成为宫颈癌发病机理的研究热点，有研究证实，端粒酶被激活是HPV整合入宫颈细胞后由CIN向宫颈癌转化的关键步骤，其出现为有效提高宫颈癌早期筛查效率带来新的希望［2］。本研究将hTERC检测、液基薄层细胞学技术(thinprep liquidbased cytology test，TCT)、高危人乳头状瘤病毒(high risk human papilloma virus，HR-HPV)检测联合应用于宫颈癌的早期筛查，旨在探讨和分析TCT技术结合HPV分型和hTERC基因检测在妇女宫颈病变筛查中的临床应用价值。

1 材料与方法

1．1 研究对象

选择2010年5月至2012年1月因怀疑宫颈病变在佛山市妇幼保健院宫颈门诊行TCT检查的患者100例为研究对象，年龄20～65岁，平均年龄41岁±10．6岁。同时行HR-HPV检查、hTERC检测及阴道镜下病理活组织检查。所有患者均非孕期及经期，取材前3天内无性生活、阴道冲洗及用药史等。以病理组织学为金标准，其结果包括非CIN病变18例、CIN65例(包括CIN1 24例，CIN2 21例、CIN3及原位癌20例)、浸润性宫颈癌(SCC)17例。按各自病理改变分为5组。

1．2 筛查程序及结果判断

1．2．1 标本采集及TCT 按TCT常规程序进行，细胞学诊断采用2001年TBS(the Bethesda System)系统进行细胞学诊断，即未见上皮内病变及恶性细胞(NILM)、意义不明不典型鳞状细胞(ASCUS)、低度鳞状上皮内瘤变(LSIL)、高度鳞状上皮内瘤变(HSIL)、鳞状上皮癌(SCC)和腺癌 。ASCUS及以上病变即判为细胞学检查阳性。标本经制片后留取剩余液基，用于hTERC基因及HPV检测。

1．2．2 HCⅡ法检测HR-HPVDNA 应用美国Digene公司第二代杂交捕获试验(hybridcapture，HC2)检测13种高危HPV DNA含量，高危型HPV DNA＞l pg/ml者定为阳性，操作过程按试剂盒说明书进行。

1．2．3 免疫荧光原位杂交法(FISH)检测 hTERC基因异常扩增 TCT方法取材，hTERC探针由北京金菩嘉医疗科技公司提供，为hTERC/CSP3DNA探针，按探针试剂盒说明操作。用OLYMPUSB×51荧光显微镜观察间期细胞荧光杂交信号，用Video Test公司提供的FISH分析软件分析图像，评估整个涂片的CSP3和hTERC基因双色探针杂交情况。结果判断:至少计数信号完整的100个细胞。在100×物镜下观察癌细胞核的FISH结果并进行信号计数和比值计算。将观察到的信号记录为CSP3信号数:TERC信号数(即绿:红)，正常二倍体为2∶2，出现其他类型为异常细胞类型。计算出阈值(阈值=均数+3×标准差SD)为6，超过或等于阈值标准为hTERC基因扩增阳性。阳性检测结果的判定标准:每例标本整张片随机计数≥100个细胞，如果所检细胞中出现2个以上红色信号的细胞百分比大于上述正常阈值者即为阳性，表示hTERC基因扩增异常，小于正常阈值者即为阴性，表示hTERC基因扩增正常，等于正常阈值者应增加受检细胞个数再确定结果。

1．2．4 病理学检查 阴道镜下对病变最严重处多点取材活检，如无异常，则常规取移行带第3、6、9、12点4处。标本固定后行病理检查，结果包括炎症(非 CIN)、CIN1、CIN2、CIN3 和浸润癌(SCC)5 组。其中CINI为低级别CIN病变，CIN2和3为高级别CIN病变。

1．2．5 统计分析 采用SPSS 13．0统计软件包，各组计数资料采用χ2检验，检验水平(α)为0．05。

2 结果

2．1 不同病理分型患者细胞学(TCT)检查情况

LSIL包括 HPV感染和 CIN1，HSIL包括 CIN2及CIN3［3］。非CIN组TCT结果中，出现2例ASCUS，占11．1%(病理学证实为炎性)。CIN1组中有3例 NILM，6 例 ASC-US，1 例 HSIL，共占 41．7%。CIN2患者中有2例 ASC-US，5例出现 LSIL，共占32．33%。CIN3患者中有2例出现ASC-US，4例出现LSIL，共占30%。浸润癌组有2例出现LSIL，2例出现HSIL，共占23．53%。见表1。

表1 不同病理分型患者宫颈脱落细胞TCT诊断结果(%)

2．2 不同病理分型患者高危HPV及hTERC基因表达情况

随着宫颈病变病理级别的递增，脱落细胞高危HPV的表达及hTERC基因扩增出现递次增高。高危HPV感染在CIN组及浸润癌组中的表达率均较高，统计分析非CIN组与CIN组差异有统计学意义(χ2=7．31，P ＜0．01)，CIN 各组感染率均较高，但三组间比较差异无统计学意义(χ21:2=0．83，χ21:3=1．16，χ22:3=1．02，P 均 ＞ 0．05)，CIN 组与宫颈浸润癌组差异无统计学意义(χ2=1．35，P ＞ 0．05)。FISH检测hTERC基因扩增率，高级别CIN组(包括CIN2及CIN3)明显高于低级别CIN1组(χ2=9．22，P＜0．01)，差异有统计学意义。见表2。

表2 不同病理分型患者hTERC及高危HPV检测结果

2．3 TCT、高危HPV及hTERC基因扩增与病理检查结果比较

TCT可筛查出大部分非CIN病变，复合率达88．9%，与CIN病变组及宫颈癌组相比较差异均有统计学意义(χ2 非CIN:CIN=8．96，χ2 非CIN:宫颈癌 =11．34，P均 ＜0．01)，但CIN 组与宫颈癌变组差异无统计学意义(χ2=0．92，P ＞0．05)，且筛查高级别CIN病变及宫颈癌筛查率与低级别CIN组差异无统计学意义(χ2=1．31，P ＞0．05)。高危 HPV 检查筛查高级别CIN病变及宫颈癌与低级别CIN组差异无统计学意义(χ2=0．92，P ＞ 0．05)。hTERC 基因在高级别CIN病变及宫颈癌中的扩增较低级别CIN病变差异有统计学意义(χ2=7．63，P ＜0．01)。经计算 TCT检测宫颈病变灵敏度53．4%、特异度92．5%，高危HPV检测宫颈疾病灵敏度96．7%、特异度44．6%，hTERC基因扩增识别高级别CIN病变及宫颈癌特异度98．6%，灵敏度71．7%。可见，三种方法在宫颈病变的筛查中各有优缺点:细胞学检查筛查宫颈病变特异性高但灵敏度差，高危HPV检测灵敏度高但特异性差，两者结合可有效提高宫颈病变检出率，但均不能较好区别低级别与高级别CIN病变。hTERC基因扩增识别高级别CIN及宫颈癌特异度高，但因对低级别宫颈病变识别率低，不能用于宫颈病变普通筛查，结合TCT及高危HPV检测两种方法应用则可在提高宫颈病变检出率同时有效提高高危CIN识别效率。见表3。

表3 三种检测方法与病理检查结果比较(%)

3 讨论

宫颈癌是严重威胁女性生命健康的恶性肿瘤之一，但由于宫颈癌存在着一个较长的、可逆转的癌前病变期，早期患者5年治愈率高达90%，因此有效地开展宫颈癌筛查是降低其发病率和病死率的唯一途径。液基细胞学(以TCT为代表)是宫颈癌前病变筛查的一大革命，使细胞学筛查的准确度和满意度得到提高，成为目前最常用的宫颈癌筛查手段。但细胞学筛查仍存在重复性差且主观性强，不能明确意义的涂片结果较多等不足［4］。从本实验结果我们可以看到，TCT对非CIN病变诊断符合率高达88．9%，但对CIN的诊断符合率不足70%，对浸润癌的诊断符合率也仅有76．48%，其阴性率较高，一定程度上导致了宫颈癌及癌前病变的漏检。本研究中TCT对高级别CIN病变和低级别CIN病变的筛查率差异无统计学意义(P＞0．05)，提示TCT缺乏识别高级别CIN病变与低级别CIN病变的特异性，特异性高但灵敏度较差。

大量流行病学和生物学资料已经证明HR-HPV感染是宫颈癌及其癌前病变的最主要病因，特别是高危型、持续性感染是引起子宫颈癌前病变和宫颈癌的主要原因［5］。HR-HPV筛查宫颈癌及癌前病变具有较高的灵敏度，如本实验中发现CIN病变患者高危HPV感染率均超过90%，浸润癌感染率达100%。液基细胞学技术联合HR-HPV检测是较理想的宫颈癌筛查方案，两者相结合能明显提高宫颈病变的检出率，较大限度地降低宫颈癌的漏诊率。但HPV感染率很高，大多数妇女感染HPV是暂时的，只有持续感染，病毒DNA整合入细胞DNA组才能导致高级别CIN发生［6］。因此，FR-HPV对宫颈上皮内高度病变的阳性预测值始终很低，这在本研究中亦得到证实，高危HPV感染率在CIN1与CIN高级别病变组差异无统计学意义(P＞0．05)。根据2009年美国国家综合癌症网络(NCCN)颁布的宫颈病变诊疗指南［7］，CIN1可予期待治疗定期随访，而CIN2及3级则需要积极手术治疗，阻断其进一步向宫颈癌发展，可见在已经能做到广泛应用TCT和(或)HPV筛查宫颈癌的今天，如何早期、准确地识别高级别的CIN病变已成为宫颈癌筛查中的重点问题。

近年由美国NIH直接领导的针对宫颈癌的研究表明，宫颈细胞由非典型向癌转变的过程中几乎都伴有3号染色体长臂扩增，其中，涉及到的最重要的基因可能是hTERC基因［8］。有研究证实宫颈癌细胞系、宫颈癌组织和CIN中均存在hTERC基因扩增，hTERC基因的异常拷贝数增加可能是宫颈癌形成的早期事件。该基因的扩增可阻止细胞凋亡，因而可导致肿瘤发生。还有研究发现3号染色体长臂能准确区分高级别CIN与低级别CIN，鉴别诊断的特异性及敏感性均在90%以上;这一扩增也能预测52%～96%的CIN有恶变的可能［9］。本研究发现各组病变中均有hTERC基因的表达，但主要表达在宫颈病变的高级别的宫颈上皮内病变阶段，其表达率与宫颈病变程度密切相关，随着病变级别升高，基因扩增率呈上升趋势，高度CIN病变组基因扩增率明显高于低度CIN病变组(P＜0．01)，结论与国内外研究相吻合。提示hTERC可能是宫颈癌形成的早期事件，TERC基因异常扩增诊断CINlI及以上病变具有良好的敏感度、特异度，敏感度明显高于细胞学检查，特异度明显高于HPV检测，可用于早期诊断宫颈癌，可能是宫颈病变进展的预测性指标。

综上所述，通过研究我们发现细胞学检查在宫颈癌的筛查中具有较高的特异性但灵敏度较差，高危HPV检测灵敏度高但特异性差，两者结合能有效地提高宫颈癌及癌前病变的检出率，但无法特异地识别高级别CIN与低级别CIN。hTERC基因在宫颈组织的表达率与宫颈病变程度密切相关，FISH法检测hTERC基因联合高危HPV-DNA和细胞学检测这两项传统的宫颈癌筛查技术，可以大大提高宫颈癌前病变的阳性检出率，可以较特异地识别出具有较高的转化为宫颈癌潜能的高级别CIN病变。对细胞学和(或)HPV阳性的患者进一步行hTERC基因检测，可较好地识别出具有发展为宫颈癌趋势的高危人群，通过早期诊断和治疗而降低宫颈浸润性癌的发病率。对细胞学阴性和(或)HPV阴性但hTERC阳性的患者亦应增加随访力度，预防宫颈癌及癌前病变的发生。

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