固态发酵笋壳生产饲料菌种混合配比优化研究

王音WANG Yin；沈勇猛SHEN Yong-meng；侯冠华HOU Guan-hua

（①中国检验认证集团宁波有限公司，宁波 315000；②浙江工商职业技术学院，宁波 315000）

（①China Certification &Inspection Group Ningbo Co.，Ltd.，Ningbo 315000，China；②Zhejiang Business Technology Institute，Ningbo 315000，China）

0 引言

我国作为世界竹子的分布中心和起源地之一，竹子资源占世界总量的30%[1]。每年3-4月份，我国竹子主产区会出产大量的竹笋。这些竹笋只有一部分用于鲜食，由于竹笋不易保鲜，所以大多数的竹笋通常是被加工成笋干或罐头。在竹笋的加工过程中，实际可食用的笋肉大概只占整个笋体的30%[2]，不可食用的笋头和笋壳则成为了加工的废弃物。以往这些废弃物只是被简单丢弃，腐烂霉变之后对环境造成了负面影响，而且极大地浪费了宝贵的生物资源。目前，国内外对笋壳加工废弃物的再利用有多种开发途径，主要都是通过微生物发酵的手段，将笋壳用于制备膳食纤维、有机肥和生产动物饲料[3]。利用笋壳生产动物饲料主要是将笋壳处理后接入纤维素分解菌和蛋白质分解菌[4]等，通过微生物的代谢活动，利用笋壳中富含的纤维素和矿物质等微量元素，有效转化分解抗营养物质，从而达到提高蛋白含量，改善笋壳的适口性的目的，制成的饲料原料养分更高且无毒害作用，从口感上来看也更能被牲畜采食、消化和吸收[5]。不仅有效消除了废弃笋壳对环境的影响，而且提高了生物资源利用率，有效缓解人畜共粮的矛盾[6]。目前发酵笋壳生产动物饲料的研究者一般只采用2-3 个菌种用于实验[7]。本研究中使用了霉菌、芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌，探索多菌种发酵的笋壳处理方式，以求达到更好更有效的发酵效果。通过对菌株混合比例、错时发酵方式等的优化，寻找有效发酵笋壳制备生物饲料的新工艺。

1 材料

1.1 菌种 自行筛选得到的具有纤维素分解能力的霉菌菌株N2 和N8，芽孢杆菌（BX2）、酵母菌（H7）和乳酸菌（G16）均由宁波大学食品微生物研究室保存提供。

1.2 培养基 芽孢杆菌BX2 采用LB 固体培养基：1%蛋白胨，1% NaCl，0.5%酵母浸膏，1.5%琼脂，加蒸馏水溶解，调节pH 值至7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。N2 与N8采用PDA 斜面培养基[8]：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15-20g，自来水1000mL，自然pH，121℃高压蒸汽灭菌20min。酵母菌H7 采用麦芽汁琼脂培养基[9]：将干麦芽磨碎，加入3.5 倍量的65℃温热水3.5-4Kg，于58-60℃保温糖化3-4h，用碘液检查糖化完全后，将其煮沸，琼脂10-15%。乳酸菌G16 采用乳酸菌分离培养基[10]：水100ml、牛肉膏1g、蛋白胨1g、酵母膏1g、番茄汁20g、葡萄糖1g、吐温0.05ml、碳酸钙1.7g、溴甲酚绿0.01g、琼脂1-2g。PDA液体培养基[11]：马铃薯200g，葡萄糖20g，自来水1000mL，自然pH，121℃高压蒸汽灭菌20min。固体发酵培养基：笋壳粉90%，麸皮8%，（NH4）2SO42%，含水量65%，自然pH。

2 试验方法

2.1 菌株兼容性实验 按照表1 的设计，从五个菌株（N2、N8、BX2、H7 和G16）中每次取三个，呈三角状点植于PDA 平板上（分组方案见表1），经过4d 培养，观察各菌株的生长情况以及互相之间的影响。

若相邻两菌株均能正常生长，两个菌落交接处自然融合，则判定为两菌种能相容；若相邻两菌株起初长势基本相当，后其中一菌落出现生长减慢的情况，菌落交接处略有间隙，则判定为两菌种部分相容；若两菌株间存在相当明显的生长趋势的差别，其中一菌落被另一菌落包围且相接处有明显分割线，则判定为两菌种不能相容。

2.2 液体种子的制备 按照1.2 分别接种五个备选菌株，28℃培养活化，待观察发现产生孢子成熟后用无菌生理盐水将孢子洗下，并稀释成浓度为107个/mL 的孢子悬液。将5mL 孢子悬液接入装有70mLPDA 液体培养基的三角瓶中，28℃摇床培养1d。

2.3 菌株接入方式

2.3.1 N2、N8 和BX2 混合比例 将N2、N8 和BX2 的液体种子分别按不同的比例混合，按10%的接种量将混合后的液体种子接入固体发酵培养基中，于恒温箱中以37℃条件下培养72h。发酵结束后分别测量产物中粗蛋白含量和CMC 酶活，选择粗蛋白含量和酶活都较高的配比为最佳的菌株配比。

2.3.2 G16 和H7 的错时接入方式 利用2.3.1 试验所筛选出来的最佳菌株配比在固体发酵培养基中接入混合液体种子，于恒温箱中以37℃下培养，然后按照表2 设计的方案，以不同的方式接入G16 和H7 的液体种子，72h 发酵结束。

以未接入G16 和H7 的固体培养基为对照，分别测量发酵产物中粗蛋白含量和CMC 酶活，选择粗蛋白含量和酶活都较高的接入方式为最佳的错时接入方式。

表2 G16 和H7 错时接入方式实验组

2.4 粗蛋白含量测定

运用凯氏定氮法，测定粗蛋白含量。

2.5 CMC 酶活测定 取1.5ml 0.05 mol/L 醋酸缓冲液配制的1.0%羧甲基纤维素钠溶液，加入0.2ml 粗酶液，50℃反应20min，用DNS 法测定反应后还原糖（葡萄糖）含量，同时做空白对照扣除本底。酶活定义[12]为上述条件下，1ml 发酵液1min 催化底物生成1μmol 葡萄糖的酶量为一个酶活力单位“U”。

2.6 发酵效果评价 对发酵产品的气味、色泽和质地进行观察。由于发酵产物的气味最能直接反应发酵效果，而色泽和质地也能同时从不同的感官角度评价发酵的成败，因此设计表3 评价笋壳粉的发酵效果。

3 结果与分析

3.1 兼容性实验结果

按照表1 的设计将五个菌株分组培养后，通过观察各菌株的生长情况以及互相之间的影响后，对各菌株之间的兼容性作出评价，评价结果见表4。

通过实验对比，发现个别菌株两两共生时，存在其中一个菌株生长较缓慢，菌落之间相接触部分较小的情况。而大多数菌株两两之间都能够良好生长，两个菌落相交处接触紧密。总体而言，这五个菌株之间都均没有强的拮抗作用，在一起能共存，呈现出较好的兼容性。因此，五个菌株都可以用于在同一个发酵体系内生长。

3.2 混菌接入方式试验结果

3.2.1 N2、N8 和BX2 的最佳混合比例 将N2、N8 和BX2 按照不同比例混合，按照10%的接种量接入固体发酵培养基中，于37℃条件下培养72h 后，测量产物中粗蛋白含量和CMC 酶活，测量结果见表5。

表3 感官评分标准

表4 菌株兼容性评价结果

通过对比表5 中粗蛋白的含量和CMC 酶活，可以得到以下结论：N2 和N8 混菌发酵产生了叠加效应，推测是这两个菌株分别产生不同种类的纤维素分解酶，共同作用的时候产生了功能互补，从而达到了更好的发酵效果。N2，N8 和BX2 以3:2:1 的比例接入固体培养基后共同发酵，三个菌株之间发挥了最佳的协同作用，CMC 酶活达到最高值26.4U/mL，发酵产物中粗蛋白含量最高，为20.33%，比空白组中粗蛋白含量提高了57.8%，是最适合的菌种混合比例。

表5 三菌种混合发酵效果

3.2.2 H7 和G16 的最佳错时接入方式 将N2、N8 和BX2 按照3:2:1 的比例接入固体发酵培养基，发酵一定时间后按照表2 的设计，以不同方式接入菌种H7 和G16，72h 发酵结束后测量发酵产物中粗蛋白含量和CMC酶活，测量结果见表6。

根据表6 显示的数据可见，按照实验组F（将纤维素分解菌N2、N8 和芽孢杆菌BX2 以3:2:1 的比例接入固体培养基发酵24h 后同时接入2%的乳酸菌G16 和2%的酵母菌H7）的设计进行发酵，72h 后得到的发酵效果最佳。发酵产物中粗蛋白含量为24.36%，比对比组A 组的粗蛋白含量提高了19.8%。CMC 酶活提高到30.2U/mL，比A 组提高了14.4%。

3.2.3 发酵效果评价 观察发酵结束后产品的气味、色泽和质地，结合表3 的评价方式，感官评价结果见表7。由表7 所示感官表现，产品的感官评价结果分值为8 分。说明按照如上的发酵方法处理笋壳粉，发酵出来的产品作为饲料，其外观量好，适口性强。

表6 五菌种混合发酵效果

表7 笋壳发酵后感官评价结果

4 结论

通过以上固体发酵实验证明，当N2，N8 和芽孢杆菌BX2 以3:2:1 的比例接种在固体发酵培养基中发酵24h 后同时接入2%的乳酸菌G16 和2%的酵母菌H7，各菌种之间达到最佳的共生和营养作用，产生了最大量的纤维素分解酶，CMC 酶活达到30.2U/mL，有效提高了固体培养基中粗蛋白的含量，使粗蛋白含量提高到24.36%，且发酵产品的外观良好，是最佳的混菌配比和接入方式。

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