两种非病毒载体介导microRNA转染的对比

高 聪，黄 莉，梁 兵，袁 芳，龙友明，郑扬波，陈梦宇

(广州医科大学 1.神经科学研究所； 2.附属第二医院 神经内科，广东 广州 510260)

两种非病毒载体介导microRNA转染的对比

高 聪1，2*，黄 莉1，梁 兵2，袁 芳2，龙友明1，郑扬波1，陈梦宇1

(广州医科大学 1.神经科学研究所； 2.附属第二医院 神经内科，广东 广州 510260)

microRNA作为核酸类药物，在细胞和生物体内存在稳定性差，半衰期短，转染效率低，靶向性差[1]，故转染过程需要高效、高安全性的载体。Lipofectamine是常用的转染脂质体，可与DNA形成复合物，有较强的转染能力。聚乙烯亚胺 (polyethyleneimine, PEI) 属阳离子聚合物，在体内外均有较高的转染效率，不良反应较低[2]。选择适合的小分子RNA基因载体对其后续研究至关重要。本研究分别选择了脂质体lipofectamin2000和阳离子聚合物PEI作为microRNA的转染载体，在体外检测其在悬浮细胞THP-1中的转染效率和细胞死亡率，比较两种转染载体的转染特性及作为microRNA基因载体的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料：1)试剂PEI(Sigma公司，408727-100 mL)；has-miR-155 mimics、Hairpin-it miRNAs q-PCR Quantitation Kit(上海吉玛制药技术有限公司)；lipofectamin2000转染试剂盒(invitrogen，lot no.569165)等。2)细胞系：人单核巨噬白血病细胞THP-1(ATCC)。

1.2 方法：1)PEI介导FAM标记的microRNA(miR-155 mimics)转染效率评估。2)荧光镜下观察microRNA转染效果，取对数生长期的THP-1细胞以完全培养基在24孔板中培养。实验分为 4组：①空白组：不加转染试剂，不加miRNA；②空转组：不加转染试剂，只加miRNA；③Lipo组：用Lipofectamine 2000/miR-155复合物转染；④PEI组：用PEI/miR-155复合物不同N/P比值(指的是PEI/microRNA复合物中 PEI分子所含的 N原子与microRNA分子中所含的P原子的摩尔比)转染，比值分为60∶1、50∶1、40∶1、30∶1、20∶1和10∶1组，Lipo/miR-155复合物以2 μL/20 pmol配得，按说明书操作转染，每组实验重复3次。3)转染效率及细胞死亡数，同上实验分4组进行转染，转染后24 h，分别以DAPI、PI染色，在荧光镜下观察。转染后用流式细胞仪分别检测转染效率及细胞死亡数，筛选出转染效率最优体系。实验重复3次结果取平均值。

1.3 has-miR-155 mimic的转染在THP-1中的表达：用上述实验筛选出转染效率最优体系PEI与microRNA的N/P=30，按此体系转染。实验分为 2组：① 空白组②PEI/microRNA组。转染后抽提THP-1细胞总RNA，反转录后作q-PCR检测各组miR-155在细胞内的相对表达量。

2 结果

2.1 PEI介导FAM标记的microRNA转染效率评估：1)荧光镜下观察转染效率，可见lipo组与PEI组转染后，均有带荧光的细胞；随着PEI与microRNA的N/P比值逐渐下降，带有荧光的细胞数量逐渐减少。两组细胞中荧光主要分布在胞质中，也有分布于胞核内；PI染色后，lipo组转染细胞死亡数比PEI组转染的细胞死亡数多(图1)。

2)流式细胞仪检测不同组别转染效率和死亡率：转染率中lipo组和PEI各组转染效率明显高于空白组和空转组；PEI组N/P为30∶1、50∶1、60∶1组转染效率均明显高于lipo组； PEI组N/P为10∶1、20∶1死亡率明显低于lipo组；PEI组N/P为50∶1、60∶1死亡率明显高于lipo组。根据以上结果，筛选出PEI组的N/P值30∶1为最优转染体系(图2)。

2.2 miR-155 mimic的转染在THP-1中的表达：转染miR-155 mimics后THP-1细胞内miR-155的相对表达量，以PEI/microRNA N/P=30转染后miR-155在细胞内的相对表达量(1.32±0.70)明显高于空白组(4.37±0.75)，可认为PEI/microRNA组能有效转染microRNA，介导miR-155在细胞内的过表达。

3 讨论

研究发现RNA干扰可成为体内实验的强有力工具，并有望成为一种有效的疾病治疗手段。基因治疗关键步骤之一就是将基因转染进入细胞，转染过程需要高效、高安全性的载体。本实验通过荧光显微镜观察两种载体转染miRNA分子均能够进入细胞质，进而进入RNAi 作用通路。影响转染效率的因素包括：细胞种类、细胞本身状态、载体结构、载体与基因混合比例等[3]。 Fischer等对聚合物进行了体外细胞毒性实验，发现阳离子聚合物的毒性与阳离子聚合物的分子质量、电荷密度、空间构型以及阳离子聚合物与核酸结合的复合物的表面电位等因素有关[4]。已知PEI的转染效率与N/P相关。为优化转染效果，有必要筛选出最优转染体系。本实验PEI组N/P=20和30时，转染率较高，死亡率较小，可选择作为基因转染体系。PEI转染miR-155后，miR-155在细胞内表达量显著增高，可见转染后miR-155在胞内有一定稳定性。

A.blank control；B.Lipo/miR-155；C.PEI/miR-155；1.in light microscope；2.green fluorescence in microscope；3.dyed with DAPI；4.dyed with PI

图1转染miR-155mimics-FAM的THP-1细胞经DAPI和PI染色后荧光显微镜图
Fig1THP-1cellstransfectedmiR-155mimics-FAMbydifferentdeliveryvectors,weredyedwithDAPIandPI(×400)

CON.blank control；NC.negative control；Lipo.lipo2000/miR-155；PEI 10～60.PEI/miR-155 N/P 10∶1～60∶1；*Plt;0.05 compared with lipo2000/miR-155图2 流式细胞仪检测不同载体组别转染的效率和死亡率Fig 2 Flow cytometry detects transfection efficiency and PI stain of different groups(±s,n=9)

综上所述，PEI在介导miRNA转染THP-1细胞的效率可优于lipofectamin2000。PEI可作为一种良好的基因载体用于体外转染miRNA，这为进一步研究PEI介导的miRNA分子体内基因沉默效应的机制和体内外基因治疗提供了依据。

[1] Takakura Y.Towards therapeutic application of RNA-mediated gene regulation [J].Adv Drug Deliv Rev,2009, 61:667.

[2] Shen J, Xu R, Mai J,etal.High capacity nanoporous silicon carrier for systemic delivery of gene silencing therapeutics [J]. ACS Nano, 2013, 7:9867-9880.

[3] He SN, Li YL, Yan JJ,etal.Ternary nanoparticles composed of cationic solid lipid nanoparticles, protamine, and DNA for gene delivery[J]. Int J Nanomedicine, 2013,8:2859-2869.

[4] Fischer D, Li Y, Ahlemeyer B,etal．Invitrocytotoxicity testing of polycations: influence of polymer structure on cell viability and hemolysis.[J].Biomatcrials,2003,24:1121-1131.

2013-07-18

2013-12-19

国家自然基金青年项目(81100890)；广东省自然科学基金(S2013010016262)；广东省科技项目(2012B031800240,2012B061700042)；广州市属高校羊城学者科研项目(10A010G)

*通信作者(correspondingauthor)： smilegaocong@126.com

1001-6325(2014)04-0544-02

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