苦参碱减轻博来霉素致大鼠肺纤维化

曾赛丽，游晓星，张秀峰，何振华*

(南华大学 1.附属第二医院 呼吸内科； 2.病原生物学研究所, 湖南 衡阳 421001)

苦参碱减轻博来霉素致大鼠肺纤维化

曾赛丽1，游晓星2，张秀峰1，何振华1*

(南华大学 1.附属第二医院 呼吸内科； 2.病原生物学研究所, 湖南 衡阳 421001)

目的观察苦参碱对博来霉素诱导的肺纤维化大鼠的保护作用，并探讨其可能的分子机制。方法大鼠随机分为对照组、模型组、泼尼松和苦参碱处理组。模型组气管内给予博莱霉素(5 mg/kg) 建立肺纤维化动物模型。建模后第1天起，分别每日予以泼尼松(0.56 mg/kg)和不同剂量的苦参碱(50和100 mg/kg)灌胃1次。于第7、14和28天时，获取大鼠取肺组织并行HE和Masson染色。检测肺组织匀浆中丙二醛(MDA)和羟脯氨酸(HYP)含量；RT-PCR法检测肺组织血红素氧合酶(HO-1) mRNA的表达；ELISA检测TNF-α产生。结果HE染色显示，模型组7 d以炎性反应为主， 28 d可见大量的肺成纤维细胞，Masson染色见有更多胶原沉积。而苦参碱与泼尼松能明显减轻其炎性反应和纤维化程度。模型组中MDA和HYP含量较对照组显著增高(Plt;0.05)，而予以苦参碱及泼尼松干预以后，二者含量均有下降，以28 d时改变最明显(Plt;0.05)。在正常肺组织中，HO-1处于低表达状态，TNF-α含量低。而模型组二者的含量明显上升(Plt;0.01)，苦参碱干预后，两者表达水平显著降低(Plt;0.05)。结论苦参碱具有减轻肺纤维化形成的作用，其机制可能与调节机体氧化-抗氧化失衡，抑制TNF-α的产生以及下调HO-1的表达水平有关。

苦参碱；血红素氧合酶-1；肿瘤坏死因子-α；肺纤维化

肺纤维化(pulmonary fibrosis，PF)是一种以肺泡上皮的损伤、炎性细胞聚集和成纤维细胞过度增殖为病理特征的弥漫性肺间质性疾病[1]。目前其发病机制尚未明了，但氧化应激在炎性反应和免疫介导的组织损伤中起了重要作用。氧自由基不仅可直接损伤细胞和组织，而且能调节一系列炎性介质的产生和释放[2-3]。其中一些炎性细胞因子又可诱导内源性氧自由基的产生，进一步促进了氧化-抗氧化失衡生，形成恶性循环。血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)是一种应激蛋白，是机体最重要的内源性保护体系之一，但HO-1的过度表达也可能是参与肺纤维化的重要因素[4-5]。

目前肺纤维化治疗推荐糖皮质激素和硫唑嘌呤或环磷酰胺联合治疗方案[6]。近年来苦参碱(Matrine)在抗纤维化中的作用已经得到了广泛的研究，但对肺纤维化是否也具有拮抗作用，目前仍不清楚[7-8]。本研究拟通过博莱霉素诱导建立的大鼠肺纤维化模型，探索苦参碱对博来霉素致大鼠肺纤维化的影响，并观察苦参碱是否可以通过下调HO-1和TNF-α发挥作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物与主要试剂

SPF级雄性SD大鼠90只，体质量180～200 g，(南华大学实验动物中心提供，合格证号：2009A023)。食用标准饲料，实验期间大鼠均自由饮水。苦参碱粉针剂(纯度98%，吉林玉皇药业有限公司，批号081123)，醋酸泼尼松片(天津太平洋制药有限公司生产，批号080201)，注射用盐酸博来霉素(日本化药株式会社生产，批号740104)。Trizol试剂(Invitrogen公司)，Quant一步法 RT-PCR试剂盒(Tiangen)。兔抗鼠HO-1多克隆抗体、HPR标记羊抗兔多克隆抗体(Santa Cruz公司)。丙二醛和羟脯氨酸测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)。TNF-α ELISA试剂盒(深圳欣博盛生物科技有限公司)。

1.2 实验分组与处理

将大鼠随机分为正常对照组、模型组、泼尼松处理组和苦参碱干预组(每组18只)。用腹腔注射10%水合氯醛麻醉(2.5 mL/kg)，经气管软骨环间隙缓慢注入0.3 mL博莱霉素溶液(5 mg/kg)。苦参碱组每天以50和100 mg/kg苦参碱溶液灌胃1次，泼尼松组每天以5 mg/kg泼尼松灌胃1次，正常对照组和模型组以等量0.9%氯化钠注射液灌胃。

1.3 肺组织病理组织学检查

肺组织用10%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋。常规脱水，透明，封片。Masson染色根据试剂盒提供的步骤进行操作，主要包括切片脱蜡处理、Masson复合染色，最后脱水，透明，封固。

1.4丙二醛(malondialdehyde，MDA)和羟脯氨酸(hydroxyproline，HYP)测定

取0.1 g肺组织解冻后，匀浆，按南京建成生物工程研究所提供的丙二醛、羟脯氨酸测定试剂盒说明书进行操作，使用可见光分光光度计测得各管吸光度值，按照说明书上公式计算肺组织丙二醛和羟脯氨酸含量，单位分别为nmol/mg·protein和μg/mg·protein。

1.5 RT-PCR检测HO-1 mRNA的表达

采用Trizol法提取肺组织总RNA。设计HO-1特异性引物：正向：5′-TGATAGAAGAGGCCAAGACT GCGTT-3′；反向：5′-TGAGTGTAAGGACCCATCGGA GAAG-3′，扩增产物228 bp。内参β-actin正向引物：5′-CCTAAGGCCAACCGTGAA-3′，反相引物：5′-CTAGGAGCCAGGGCAGTAATC-3′，产物635 bp。扩增条件：94 ℃变性2 min；随后94 ℃ 30 s，57 ℃退火30 s；65 ℃延伸1 min；共35个循环；最终延伸10 min。以目的基因/内参的吸光度比值表示。

1.6 ELISA检测TNF-α 产生水平

取肺组织后，加入一定量的PBS(pH 7.4)，用手工匀浆器将标本匀浆充分。3 000r/min离心20 min，收集上清。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 肺组织病理变化

HE染色结果显示，空白对照组大鼠肺组织结构清晰。模型组28d时肺泡结构破坏或消失，肺泡间隔明显增宽，肺泡结构受压萎缩，肺泡腔变窄。而苦参碱组(100 mg/kg)和泼尼松组病理变化程度都轻于模型组。Massosn染色结果显示，肺组织内可见大量胶原纤维沉积，融合成片。苦参碱组及泼尼松组相应时间点肺纤维化程度均低于模型组(图1)。

2.2苦参碱对肺纤维化大鼠肺组织中MDA和HYP的影响

与空白对照组相比，模型组MDA水平最高(Plt;0.05)。泼尼松和不同浓度苦参碱处理后，MDA含量明显降低(Plt;0.05)。与空白对照组比较，各模型组大鼠肺组织中HYP含量均升高(Plt;0.05)，100 mg/kg苦参碱处理后， HYP含量显著降低(Plt;0.05)(表1)。

A.HE staining； B.Masson staining图1 28 d时各组肺组织病理学改变Fig 1 Pathologic change in the lung tissue at 28 days(×100)

表1 各组MDA和HYP的含量Table 1 MDA and HYP concentration in the four groups(±s,n=3)

*Plt;0.05 compared with control；#Plt;0.05 compared with model.

2.3苦参碱对肺纤维化大鼠肺组织中HO-1mRNA表达的影响

与空白对照组相比，模型组大鼠肺组织中HO-1 mRNA的表达明显增加。药物干预后，苦参碱低剂量组、苦参碱中剂量组及泼尼松组与模型组相比，其HO-1 mRNA表达均相对降低(Plt;0.05)，尤以7 d时苦参碱中剂量组及泼尼松组明显(图2)。

1.marker；2.control；3.model；4.prednisone；5.matrine(100 mg/kg)；6.matrine(50 mg/kg)图2 第7天各处理组HO-1 mRNA表达情况Fig 2 HO-1 mRNA expression in groups at 7days

表2 7 d HO-1 mRNA灰度扫描比值Table 2 Expression of HO-1 mRNA(±s,n=3)

*Plt;0.05 compared with control；#Plt;0.05 compared with model.

2.4苦参碱对肺纤维化大鼠肺组织中TNF-α表达的影响

与空白对照组相比，模型组大鼠肺组织中TNF-α的表达明显升高,7 d时为最高峰，后呈逐渐下降；予以药物干预以后，与模型组比较，苦参碱低剂量组、苦参碱中剂量组及泼尼松组TNF-α表达均降低(Plt;0.05)，尤以苦参碱中剂量组及泼尼松组降低明显(Plt;0.01)(图3)。

*Plt;0.05 compared with control; #Plt;0.05 compared with model图3 不同处理组TNF-α水平变化Fig 3 TNF-α concentration in different groups

3 讨论

苦参碱来源于豆科植物苦参、苦豆子及广豆根中，特别是在抗组织纤维化治疗方面的作用，受到极大的关注。氧化应激是肺纤维化的重要发病机制之一。氧自由基能够攻击生物膜上的不饱和脂肪酸，引起脂质过氧化。MDA是其产物之一，因而MDA含量变化可以反应机体组织细胞氧化损伤程度。HYP是机体胶原蛋白的主要成分之一，为胶原蛋白所特有，可作为衡量胶原组织代谢的重要指标。本实验发现，MDA、HYP含量与对照组相比，模型组明显升高。予以苦参碱及泼尼松干预后，MDA的含量有下降，HYP含量下降，病理学检查提示肺组织的肺纤维化程度减轻。说明苦参碱能减轻博来霉素导致肺组织脂质过氧化损伤，具有抗氧化作用，能调节机体氧化抗氧化平衡，具有抗纤维化形成的作用。HO-1是内源性的抗氧化剂，机体存在氧化损伤时，HO-1就会增加。本研究也发现HO-1在对空白照组表达呈低水平状态，予以博来霉素建模后，肺内的HO-1表达增加，提示氧化损伤参与肺纤维化。但是在使用苦参碱干预后，MDA和HO-1水平有所下降。这可能是由于苦参碱本身具有抗氧化能力，可以增加机体抗氧化水平，调节氧化抗氧化失衡，能协同抗氧化酶HO-1共同发挥抗氧化损伤作用。

近年来，关于TNF-α在肺纤维化中的作用倍受关注[9]。本实验结果表明： TNF-α在模型组中7 d时处于高峰，随后逐渐下降，而肺组织7 d可以看见肺泡性反应与肺纤维化开始形成共同存在。苦参碱可能通过抑制TNF-α表达，抑制早期炎性反应，从而进一步减轻对其他致纤维化细胞因子的激活，而减轻肺纤维化。其机制可能是在肺纤维化早期通过介导肺泡炎性反应和肺损伤发挥作用，可以直接或间接激活其他致纤维化细胞因子[10]。

在博来霉素致肺纤维化的过程中，氧化损伤可能启动前炎性反应，炎性反应再导致组织氧化损伤。如何在二者中找到一个平衡点，对于寻找抗肺纤维化新的治疗方法具有重要的意义。苦参碱作为一种中药，能够调节机体氧-化抗氧化失衡，以双重作用抗肺纤维化，且不良反应小，具有良好的应用前景。

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Matrine alleviates blemycin-induced pulmonary fibrosis in rats

ZENG Sai-li1, YOU Xiao-xing2, ZHANG Xiu-feng1, HE Zhen-hua1*

(1.Dept. of Respiratory Medicine, the Second Affiliated Hospital of University of South China;2.Institution of Pathogenic Biology, University of South China, Hengyang 421001, China)

ObjectiveTo discuss the molecular mechanism and protective effect of matrine on blemycin-induced pulmonary fibrosis rat.MethodsRats were randomly divided into five groups, the control group, model group, prednisone, matrine low dose and high dose group.Pulmonary fibrosis model was made by adminstrated blecomin (5 mg/kg) through trachea. From 1st day after modeling, the rats were fed prednisone acetate (0.56 mg/kg/d) or different dose matrine (50 and 100 mg/kg/d). At the 7, 14, 28 days of modeling, the lung tissue biopsy sections are observed by HE and Masson staining pathology. The malondialdehyde (MDA) level and hydroxyproline (HYP) content in lung tissue was detected,HO-1 mRNA was measured by RT-PCR, and by production of TNF-α. The lung tissue biopsy sections are detected by HE and Masson staining pathology.ResultsIn model group, in-flammatory response was the main event at 7 d. At 28 d, more lung fibroblast were found. The collagen was found more clearly. Pathological change in the matrine and prednisone treated group was less than that from model group. The MDA and HYP content in model group was higher as compared with normal control group (Plt;0.05), and decreased after matrine and prednisone treatment in 28 d (Plt;0.05). In the normal lung tissue, expression of HO-1 and production of TNF-α was very low, and increased in the model group. After drug intervention, the level of both TNF-α and HO-1 was decreased (Plt;0.05).ConclusionsMatrine can alleviate the fibrosis status in rats, and the mechanism may be associated to regulate oxidative-antioxidant imbalance and inhibition of TNF-α and HO-1 expression.

matrine; heme oxygenase-1; tumor necrosis factor-α; pulmonary fibrosis

2013-06-27

2013-11-04

湖南省科研条件创新专项(2010TT2022)；湖南省卫生厅科研计划(B2009058)；衡阳市科学技术发展计划(2009KJ42)

*通信作者(correspondingauthor)： Hezhenhua0734@163.com

1001-6325(2014)04-0504-05

研究论文

R 563.9

A