TBB通过WNT/β-catenin通路抑制甲状腺滤泡状癌细胞FTC133的增殖与迁移

王翠瑶，刘 超，任丽莉，张晓玉，孙 静，肖建英

(辽宁医学院 基础医学院 生物化学与分子生物学教研室， 辽宁 锦州 121001)

研究论文

TBB通过WNT/β-catenin通路抑制甲状腺滤泡状癌细胞FTC133的增殖与迁移

王翠瑶，刘 超，任丽莉，张晓玉，孙 静，肖建英*

(辽宁医学院 基础医学院 生物化学与分子生物学教研室， 辽宁 锦州 121001)

目的观察四溴苯三唑(TBB)对甲状腺滤泡状癌细胞系FTC133的CK2α、β-catenin和SURVIVIN的mRNA和蛋白表达的影响，探讨TBB抗甲状腺癌的作用机制。方法体外培养FTC133细胞，分对照组(DMSO组)和TBB组(终浓度为12.5、25和50 μmol/L)，MTT法测定细胞增殖抑制率；划痕实验测定细胞迁移；RT-PCR和Western blot法分别检测FTC133细胞CK2α、β-catenin和SURVIVIN的mRNA和蛋白表达。结果与对照组比较，TBB呈剂量依赖性抑制FTC133细胞的增殖和迁移。各TBB处理组CK2α mRNA表达水平明显降低(Plt;0.01)；TBB组随着浓度的逐渐加大，CK2α、β-catenin和SURVIVIN蛋白表达下降(Plt;0.01)。结论TBB在一定浓度范围内抑制甲状腺滤泡状癌细胞系FTC133的增殖和迁移，其机制可能与TBB下调CK2α表达进而抑制WNT/β-catenin信号通路有关。

四溴苯三唑；甲状腺滤泡状癌；CK2α；β-catenin；SURVIVIN

蛋白激酶CK2是一种真核细胞中普遍存在和高度保守的信使非依赖性丝/苏氨酸蛋白激酶，在细胞生长、转化、生存、增殖、凋亡和肿瘤发生过程中都发挥重要作用[1- 2]。CK2 是由催化亚基α、α′和调节亚基 β组成的四聚体，其中蛋白激酶CK2α具有癌基因作用，它的磷酸化底物可能涉及到许多蛋白的调节[3- 4]。研究报道，过表达CK2α增强β-catenin的转录活性和SURVIVIN的蛋白表达，并抑制HEK- 293T细胞凋亡[5]。但CK2α、β-catenin和SURVIVIN在甲状腺癌细胞中的表达尚未见报道。高选择性膜通透CK2抑制剂四溴苯三唑(4,5,6,7-tetrabromobenzotriazole，TBB)具有抗肿瘤作用，它可能成为肿瘤治疗的重要靶药物[6]，但TBB对甲状腺癌的作用机制尚不清楚。本研究通过选用不同浓度TBB作用甲状腺滤泡状癌细胞系FTC133，旨在探讨TBB对人甲状腺癌细胞CK2α、β-catenin和SURVIVIN的影响，为TBB的临床开发应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

TBB[T0826-10MG,≥98% (HPLC)，Sigma公司]；DMEM/F12培养液(11330-032-500 mL，Gibco公司)；胎牛血清(PAA公司)；CK2α(C-18)(sc-6479)、β-catenin(C-18)(sc-1496)、SURVIVIN(C-19)抗体(sc-8807)和β-actin抗体(sc-130656)(Santacruz公司)；HRP标记的山羊抗兔和兔抗山羊IgG(ZB-2301和ZB-2306，北京中杉金桥生物技术有限公司)；ECL化学发光试剂盒(32109，Piece Biotechnology公司)；RNA PCR Kit (AMV)Ver.3.0试剂盒(DRR019A，Takara公司)；MTT、Western细胞裂解液和BCA蛋白浓度测定试剂盒(北京碧云天生物技术公司)。

1.2 细胞培养及实验分组

低分化滤泡状甲状腺癌细胞系FTC133(上海交通大学医学院附属新华医院核医学科王辉教授惠赠)培养基为DMEM/F12，含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL的链霉素，在饱和湿度、37 ℃和无CO2孵箱中培养。当细胞处于对数期时，以合适浓度接种于培养板或培养瓶，待细胞贴壁后给药，TBB组终浓度分别为0、12.5、25和50 μmol/mL，对照组加入5 μL DMSO [DMSO浓度小于0.1%(V/V)，此浓度对细胞生长无影响]。

1.3 MTT法测定细胞增殖抑制率

取96孔板中对数生长期FTC133细胞，弃去上清液，实验组分别加不同浓度TBB，对照组加入等体积DMSO的培养基，空白组加入等体积的培养基，各浓度组6个复孔，继续培养12、24和48 h后，20 μL MTT(5 g/L)孵育4 h。弃去培养液，加入150 μL二甲基亚砜，振荡15 min，使沉淀物充分溶解。酶联免疫检测仪测定各孔吸光度值，计算各时间点细胞增殖抑制率。每组实验重复3次。

1.4 划痕实验测定细胞迁移能力

将生长至汇合度达90%的FTC133细胞，用黄枪头划痕，PBS清洗3次，利用倒置显微镜标尺，测量划痕宽度；细胞加TBB处理后不同时间点(0、6、12、24和48 h)监测划痕宽度变化，并照相。

1.5RT-PCR方法检测CK2α、β-catenin及SURVIVIN的mRNA表达水平

Trizol法提取各组细胞总RNA并测定RNA浓度。按照TaKaRa RNA PCR(AMV)Ver3.0试剂盒的操作步骤进行反转录和PCR。反转录条件42 ℃，30 min；99 ℃，5 min；5 ℃，5 min。PCR引物序列CK2α(5′-CCGAGTTGCTTCCCGATAC-3′，5′-GGGC TGACAAGGTGCTG AT-3′，315 bp)；β-catenin(5′-CGGTACATGCATGACTGAGAC-3 ′，5′-GTCACGTGG TACGACGTCAGAT-3′ 310 bp)；SURVIVIN(5′-CC AAGGTCTGGCTCGTTCTCATG-3′，5′-GCGCACTTTC TCCGCAGTTTC-3′，357 bp)；β-actin(5′-TGACGGGG TCACCCACACTGTGCCCATCTA-3′，5′-CTAGAAGC ATTTGCGGTGGACGATGGAGGG-3′，661 bp)。PCR反应条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃ 30 s；X ℃(CK2α 52.2 ℃、β-catenin 60 ℃、SURVIVIN 62 ℃) 30 s；72 ℃ 1 min；30个循环；72 ℃终延伸7min。取PCR产物10 μL进行琼脂糖凝胶电泳并拍照，并测量吸光度，mRNA表达水平以每一样品与β-actin吸光度比值表示。

1.6Westernblot方法检测CK2α、β-catenin和SURVIVIN的蛋白表达

用蛋白裂解液提取对数生长期细胞总蛋白并测定蛋白浓度。电泳前加入2×SDS样品缓冲液，100 ℃煮沸5 min，离心后上样，10%SDS-PAGE电泳分离，将蛋白转至硝酸纤维素膜上，用含5% 牛血清白蛋白的TBS(pH 7.4)将滤膜室温摇动2 h，封闭后的滤膜再分别与CK2α、β-catenin和SURVIVIN抗体(稀释比为1∶200) 及β-actin(稀释比为1∶1 000)4 ℃温育过夜。经TTBS洗涤后，HRP偶联的IgG作为二抗(稀释比为1∶ 000)室温温育2 h后洗膜，ECL发光法显色。Image J分析密度，计算吸光度值，内参采用β-actin。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 各组细胞增殖抑制率的变化

12.5、25和50 μmol/L TBB分别作用FTC133细胞12、24和48 h后，各组细胞增殖率随着时间和药物浓度的升高而降低(Plt;0.01) (表1)。

2.2 TBB对FTC133细胞迁移的影响

对照组(DMSO)和TBB组FTC133细胞于12 h后开始迁移，24和48 h后TBB组细胞迁移的数量较对照组少，距离相对较远。且随着TBB浓度的增加，迁移距离明显增加，24和48 h后迁移距离差异明显(Plt;0.01)(图1)。

表1 TBB(0、12.5、25和50 μmol/L)抑制FTC133细胞增殖

*Plt;0.01 compared with control group.

2.3CK2α、β-catenin和SURVIVINmRNA表达水平

与对照组比较，各剂量TBB作用FTC133细胞后CK2α mRNA表达降低，且随剂量增加表达越低(Plt;0.01)(图2，表2)。

图1 TBB抑制FTC133细胞的迁移

A.CK2α mRNA expression levels; B.β-catenin mRNA expression levels; C.SURVIVIN mRNA expression levels; M.marker; 1.DMSO; 2.12.5 μmol/L; 3.25 μmol/L; 4.50 μmol/L

图2 FTC133细胞中CK2α、β-catenin和SURVIVIN mRNA表达水平Fig 2 The CK2α, β-catenin and SURVIVIN mRNA expression levels in FTC133 cells

*Plt;0.01 compared with control group.

2.4CK2α、β-catenin和SURVIVIN蛋白表达水平

与对照组比较，各剂量TBB作用后细胞中CK2α、β-catenin和SURVIVIN的蛋白表达明显降低(Plt;0.01)，且随剂量增加表达越低(图3，表3)。

M.marker; 1.DMSO; 2.12.5 μmol/L;3.25 μmol/L;4.50 μmol/L图3 FTC133细胞经TBB(0、12.5、25和50 μmol/L)处理后CK2α、β-catenin和SURVIVIN的蛋白表达Fig 3 The CK2α, β-catenin and SURVIVIN proteinexpression levels in FTC133 cells

groupCK2α/β-actinβ-catenin/β-actinSURVIVIN/β-actincontrol0.912±0.0150.539±0.0180.377±0.020 12.50.392±0.021*0.431±0.023*0.341±0.032*TBB(μmol/L) 250.313±0.013*0.309±0.013*0.295±0.021* 500.202±0.026*0.145±0.020*0.135±0.013*

*Plt;0.01 compared with control group.

3 讨论

蛋白激酶CK2广泛表达于各种组织的真核细胞中，为细胞生长、增殖、分化所不可或缺的关键因子之一。TBB是ATP结合位点的竞争性抑制剂，是磷酸供体底物类似物，应用广泛[6]，但对甲状腺癌的作用知之甚少。本实验首先用不同浓度TBB作用甲状腺滤泡状癌细胞系FTC133，MTT法表明TBB显著抑制FTC133细胞的增殖，并呈明显的剂量依赖效应，这与我们之前的实验结果相吻合[7]。划痕愈合实验也表明TBB随着浓度的增加显著抑制FTC133细胞迁移。研究表明，CK2是哺乳动物细胞中WNT信号通路的关键调节因子，主要通过WNT信号导致β-catenin入核后与转录因子TCF结合，形成TCF/β-catenin复合体，直接激活下游基因C-MYC、CYCLIN D1和SURVIVIN的转录，介导细胞的生长、增殖和分化，参与恶性肿瘤的发生和进展[8- 9]。为探讨TBB抑制FTC133细胞增殖和迁移的可能机制，我们观察了经TBB处理后WNT信号通路中的重要成员β-catenin及下游的生长凋亡抑制因子SURVIVIN的表达情况。不同浓度TBB处理FTC133细胞后，明显下调CK2α的mRNA和蛋白水平，并随着浓度的增加，抑制作用明显增强，说明TBB能明显抑制CK2α的表达。经TBB处理后FTC133细胞β-catenin和SURVIVIN的mRNA水平不变化，而蛋白水平降低，说明TBB对β-catenin和SURVIVIN的调节可能发生在转录后、翻译或翻译后水平。结合本实验室的前期工作[7]，TBB可能通过WNT/β-catenin信号通路抑制甲状腺滤泡状癌FTC133细胞增殖与迁移，但激活CK2α的表达是否通过WNT/β-catenin信号通路发挥作用，本实验室仍在进一步研究之中。

[1] Zhang S, Long H, Yang YL,etal.Inhibition of CK2α down-regulates Notch1 signalling in lung cancercells[J].J Cell Mol Med, 2013, 17:854- 862.

[2] Zheng Y, McFarland BC, Drygin D,etal.Targeting protein kinase CK2 suppresses prosurvival signaling pathways and growth of glioblastoma[J].Clin Cancer Res, 2013,19:6484- 6494.

[3] Yao K, Youn H, Gao X,etal.Casein kinase 2 inhibition attenuates androgen receptor function and cell proliferation in prostate cancer cells[J].Prostate, 2012,72:1423- 1430.

[4] Stolarczyk EI, Reiling CJ, Pickin KA,etal.Casein kinase 2α regulates multidrug resistance-associated protein 1 function via phosphorylation of Thr 249[J]. MolPharmacol, 2012, 82:488- 499.

[5] Ponce DP, Yefi R, Cabello P,etal.CK2 functionally interacts with AKT/PKB to promote the β-catenin-dependent expression of SURVIVIN and enhance cell survival[J]. Mol Cell Biochem， 2011,356:127- 132.

[7] 刘超，刘洋，赵颂，等.蛋白激酶CK2抑制剂TBB诱导甲状腺鳞癌SW579细胞凋亡[J].中国老年学杂志, 2013, 33:128- 130.

[8] Wang S, Jones KA.CK2 controls the recruitment of Wnt regulators to target genesinvivo[J].Curr Biol， 2006, 16:2239- 2244.

[9] 桂玲，王静，祝爱珍，等. 靶向NAC- 1基因的siRNA对卵巢癌HO8910细胞生长及其Wnt/β-catenin 信号途径的影响[J]. 基础医学与临床, 2013, 33: 1581- 1585.

TBB inhibits the proliferation and migration of thyroidpapillary carcinoma cell line FTC133 via WNT/β-catenin signaling pathway

WANG Cui-yao, LIU Chao, REN Li-li, ZHANG Xiao-yu, SUN Jing, XIAO Jian-ying*

(Dept. of Biochemistry and Molecular Biology, Liaoning Medical University, Jinzhou 121001, China)

ObjectiveTo observe the effects of 4,5,6,7-tetrabromobenzotriazole(TBB) on the expressions of CK2α，β-catenin and SURVIVIN in thyroid papillary carcinoma cell line FTC133 and to explore the possible underlying mechanism.MethodsFTC133 cells were culturedinvitroand divided into control group(DMSO), TBBgroups(12.5, 25, 50 μmol/L)randomly. The proliferation rate and migration of FTC133 cells was detected by MTT and wound healing method. The CK2α, β-catenin and SURVIVIN mRNA and protein expression levels were determined by RT-PCR and Western blot.ResultsCompared with control group, the proliferation rate and migration of FTC133 cells were inhibited by TBB in a dose-dependent manner(Plt;0.01).The expression levels of mRNA and protein of CK2α were significantly decreased in the presence of different TBB in FTC133 cells(Plt;0.01), the protein expression level of β-catenin and SURVIVIN was also decreased(Plt;0.01).ConclusionsTBB inhibits the proliferation and migration of thyroid papillary carcinoma cell line FTC133 via WNT/β-catenin signaling pathway.

TBB；thyroid papillary carcinoma；CK2α；β-catenin；SURVIVIN

2014- 02- 21

2014- 05- 27

辽宁省科学技术计划(2013225305)

*通信作者(correspondingauthor)：lyxiaojy@163.com

1001-6325(2014)10-1381-05

R 581.3

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