腺病毒介导的PML(NLS-)过表达对白血病NB4细胞增殖和凋亡的影响

阳小群，王 慧，蒋开玲，朱新瑜，马鹏鹏，刘北忠*

(1.重庆医科大学 附属永川医院 中心实验室， 重庆 402160；2.重庆医科大学 临床检验诊断学教育部重点实验室 重庆市重点实验室， 重庆 400016)

研究论文

腺病毒介导的PML(NLS-)过表达对白血病NB4细胞增殖和凋亡的影响

阳小群1,2，王 慧2，蒋开玲2，朱新瑜2，马鹏鹏2，刘北忠1,2*

(1.重庆医科大学 附属永川医院 中心实验室， 重庆 402160；2.重庆医科大学 临床检验诊断学教育部重点实验室 重庆市重点实验室， 重庆 400016)

目的利用腺病毒介导PML(NLS-)的过表达，探讨PML(NLS-)对NB4白血病细胞增殖凋亡的影响。方法重组腺病毒质粒Ad-PML(NLS-)经Pac I酶切线性化后转染AD293细胞，获得重组腺病毒Ad-PML(NLS-)，经4轮扩增后，测定重组腺病毒滴度；重组腺病毒感染NB4细胞，荧光显微成像和流式细胞术检测感染效率，RT-PCR法和Western blot法检测NB4细胞中PML(NLS-)的转录及表达水平，MTT实验观察细胞增殖，流式细胞术分析细胞周期及凋亡。结果重组腺病毒质粒Ad-PML(NLS-)经酶切和测序鉴定正确，经4轮扩增病毒滴度为1×1010pfu/mL；重组腺病毒Ad-PML(NLS-)感染NB4细胞效率达75%，PML(NLS-)基因可在NB4细胞中高效表达； NB4细胞增殖活力明显高于未感染组和空病毒载体感染组(Plt;0.05)，S期细胞比例明显增高(Plt;0.05)，G2期细胞比例明显减少(Plt;0.05)；实验组细胞凋亡率明显低于空病毒感染组(Plt;0.05)。结论PML(NLS-)过表达能够促进白血病NB4细胞的体外增殖能力，抑制其凋亡。

PML(NLS-); 急性早幼粒细胞白血病; 增殖; 凋亡

急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia, APL)是急性髓细胞白血病中的一个特殊亚型，其特征性的染色体t(15；17)易位形成并表达PML-RARα融合蛋白[1]。中性白细胞弹性蛋白酶(Neutrophil Elastase，NE)可将PML-RARα融合蛋白切割成52 ku的PML(NLS-)和61 ku的NLS-RARα两种变异蛋白[2]，并且这一切割作用在APL的发生中起着重要作用[3]。本实验前期研究发现PML(NLS-)与GINS2存在相互作用[4- 5]，下调GINS2 表达能有效阻断细胞DNA 复制并促进其凋亡[6]，且NLS-RARα具有促增殖和抑制分化的作用[7]。正常PML蛋白作为一种肿瘤生长抑制因子，对不同组织起源肿瘤的发生发展具有一定抑制作用[8]。然而，目前对PML(NLS-)蛋白如何影响正常PML蛋白功能，以及在APL发生发展中所扮演的角色并无相关报道。为此，本研究PML(NLS-)蛋白过表达，对早幼粒白血病细胞系NB4细胞体外增殖和凋亡的影响，逐步阐明PML(NLS-)蛋白的功能，为进一步研究APL的发病机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒、菌株及细胞：重组腺病毒质粒Ad-PML(NLS-)、大肠埃希菌DH5α和阴性对照空载病毒Ad-KZ(本课题组前期保存)，白血病NB4细胞和AD293细胞(重庆医科大学临床诊断实验室保存)。

1.1.2 主要试剂：高糖DMEM培养基、RPMI1640培养基、胎牛血清(FBS)、青链霉素(Gibco公司)；限制性内切酶PacⅠ(Thermo Scientific公司)；高保真Taq DNA多聚酶、 PCR mixture、总RNA提取试剂盒和反转录试剂盒(TaKaRa公司)；琼脂糖、Lipofectamin 2000和Annexin V- FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(Invtrogen公司)；RIPA细胞裂解液(碧云天生物技术研究所)；兔抗人PML多克隆抗体(Abcam公司)；鼠抗人β-actin单克隆抗体、HRP标记的羊抗兔和羊抗鼠的IgG和异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗兔IgG(北京中山金桥生物技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 重组腺病毒的包装和扩增： 将重组腺病毒质粒经PacⅠ酶切后，用乙醇沉淀法纯化酶切产物。转染前6～12 h，将2×106/mL AD293 细胞接种于25 cm2细胞培养瓶中，待细胞汇合度为50%左右时，6 μL脂质体2000介导转染3 μg乙醇沉淀产物，6 h 后，更换完全DMEM 培养基，于37 ℃， 5% CO2孵箱中培养15 ～20 d。倒置荧光显微镜下观察红色荧光蛋白的表达。将收获的病毒液经“冷冻(-80 ℃)-融化(37 ℃)-漩涡振荡”后，4 ℃，12 000×g离心5 min，取病毒上清，感染AD293细胞，如此反复扩增4轮，检测重组腺病毒Ad-PML(NLS-)的滴度，-80 ℃保存。

1.2.2 重组腺病毒滴度的检测： 将AD293接种于96 孔板中，1×104/孔，培养24 h 后用无血清无抗生素DMEM培养基培养30 min；吸弃上清，加入不同稀释度的重组腺病毒(103、104、105、106、107、108、109、1010、1011和1012)100 μL /孔。每个稀释度3个复孔，于5% CO2孵箱培养2 h；加入100 μL DMEM 完全培养基，培养48 h 后，倒置荧光显微镜下计数荧光，按下式计算重组腺病毒的滴度。蚀斑形成单位(plaque forming unit, pfu)/mL= 每孔平均荧光数×10/稀释度。

1.2.3 重组腺病毒感染NB4细胞： NB4细胞用含10%优质胎牛血清的GIBCO- 1640培养基，于37 ℃，5% CO2，饱和湿度孵箱内常规培养，每1～2天传代，选择对数生长期的细胞用于后续实验；用重组腺病毒Ad-PML(NLS-)和阴性对照腺病毒Ad-KZ感染NB4细胞，48 h后收集细胞，通过荧光显微成像和流式细胞仪检测感染效率。

1.2.4 RT-PCR检测感染NB4细胞PML(NLS-)mRNA的表达： 感染48 h后提取细胞总RNA，分别取RNA各500 ng反转录成cDNA。以cDNA为模板进行PCR。通过查询NCBI，设计PML(NLS-)的引物如下：上游引物序列：5′-TCATGGAGCCTGCACC CGC-3′，下游引物序列：5′-CAGGTCAACGTCAATA GGGT-3′，扩增片段长度为1 268 bp；内参β-actin引物序列为：上游引物序列：5′-GCACCACACCTTCTAC AA-3′，下游引物序列：5′-CTCGTAGCTCTTCTCCAG-3′，扩增片段长度为466 bp。PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸80 s，共34个循环；72 ℃再延伸5 min。PCR产物凝胶电泳，采用凝胶图像分析系统进行分析，实验重复3次。

1.2.5 Western blot 检测PML(NLS-)蛋白表：感染48 h后收集细胞，RIPA裂解后提取细胞总蛋白，用BCA法定量，取50 μg蛋白提取液，进行SDS-PADE电泳，以半干转膜法转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，与一抗(兔抗人PML抗体1∶1 000稀释)，4 ℃孵育过夜。洗膜，与二抗(辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG 1∶2 000稀释)，37 ℃孵育1 h，然后洗膜。于暗室化学发光显影成像，以β-actin作为内参，实验重复3次。

1.2.6 MTT法检测细胞增殖活力：收集对数生长期细胞，按照1×104/孔，铺于96孔板中，每组3个复孔，感染病毒，5% CO2、37 ℃孵育，分别于12、24、36、48、60和72 h后加入5 g/L MTT每孔20 μL，常规培养4 h；离心弃上清，每孔再加入150 μL DMSO，振摇10 min，在酶联免疫检测仪上测定490 nm波长处各孔的吸光度值。实验重复3次，以时间为横坐标，A490值为纵坐标，绘制细胞增殖曲线。

1.2.7 流式细胞仪检测细胞周期：收集感染48 h后的各组细胞和空白对照组细胞，用0.01 mol/L PBS洗涤3次，70%乙醇重悬，4 ℃放置过夜，上流式细胞仪检测各组细胞的细胞周期分布，实验重复3次。

1.2.8 Annexin V-FITC/PI 双染法检测细胞凋亡：收集各组NB4细胞，按照Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒说明书操作，上流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率。实验重复3次。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 重组腺病毒的包装、扩增及病毒滴度

转染48 h后，AD293细胞内有少量红色荧光蛋白表达，10 d时呈彗星状分布，14 d后细胞出现病变(图1)。收集病毒，经4轮扩增，重组腺病毒的滴度为1×1010pfu/mL。

2.2 感染效率检测

感染病毒48 h后，感染效率达75%(图2)。

2.3RT-PCR检测NB4细胞中PML(NLS-)基因mRNA水平的表达

Ad-PML(NLS-)组NB4细胞扩增产物电泳可见PML(NLS-)目的基因特异性条带，位于约1 268 bp处与预期大小一致，Ad-KZ空载组和未感染组在相同位置未出现该条带(图3)。

A.infected 48 hours； B.infected 10 days；C.infected 14 days图1 重组腺病毒感染AD293细胞荧光显微镜观察Fig 1 Fluorescent microscopy of AD293 cells infected with recombinant adenovirus(×100)

图2 流式细胞仪检测感染效率Fig 2 Infection efficiency measured by flow cytometry

M.DNA marker DL2000；1.NB4/Ad-PML(NLS-); 2.NB4/ Ad-KZ; 3.NB4图3 RT-PCR验证感染细胞中的PML(NLS-)基因的表达Fig 3 The expression of PML(NLS-) mRNA in NB4cells detected by RT-PCR

2.4感染细胞中PML(NLS-)蛋白的表达

Ad-PML(NLS-)感染组在53 ku处可见与PML(NLS-)蛋白分子质量大小一致的特异性条带，而Ad-KZ空载组和未感染组在相应位置未出现相应条带(图4)。

1.NB4/Ad-PML(NLS-); 2.NB4/ Ad-KZ; 3.NB4图4 Western blot验证感染细胞中PML(NLS-)的表达Fig 4 Expression levels of PML (NLS-) protein inNB4 cells detected by Western blot

2.5 MTT法检测各组NB4细胞的增殖活力

Ad-PML(NLS-)感染组细胞生长增殖速度自24 h后明显加快，到60 h后达到高峰，随后进入平台期。与未感染组和Ad-KZ感染组相比Ad-PML(NLS-)感染组A值均显著增高(Plt;0.05)，细胞增殖活力明显增强，而未感染组和Ad-KZ感染组相比A值无明显差别(图5)。

*Plt;0.05 compared with Ad-KZ group and NC group图5 MTT法检测各组NB4细胞增殖活力Fig 5 Proliferation activities of NB4 cellsin various groups

2.6流式细胞仪检测各组NB4细胞的细胞周期和凋亡情况

与未处理组和Ad-KZ感染组相比较，Ad-PML(NLS-)感染组NB4细胞中G1期和G2期细胞比例显著降低(Plt;0.05)，S期细胞比例显著上升(Plt;0.05)，(图6，表1)。同时分析细胞凋亡情况，与未处理组相比，Ad-KZ感染组NB4细胞的凋亡率明显升高，实验组凋亡率显著低于空病毒感染组(图7，表1)。

3 讨论

APL是一组造血系统恶性克隆性疾病，其早期出血倾向严重，短期致死率高，随着全反式维甲酸(all-trans retinoic acid, ATRA)和三氧化二砷(arsenic trioxide，ATO或As2O3)的应用，使得APL完全缓解率可以达到90%～95%,但仍有12%～30%患者会复发，并对维甲酸的治疗产生耐药。除复发耐药外，尚有10%～30%的APL对ATRA并不敏感，并且ATRA的治疗存在白细胞增多症和维甲酸综合征等不良反应[9]。因此进一步探明APL发生的分子机制，寻找诊疗新靶点尤为重要。将PML-RARα导入含有中性弹性蛋白酶(neutrophil elastase， NE)的动物型中，比导入不含NE 的动物更易发展成为白血病[2]，在不含NE的早期髓细胞中，单纯导入的PML-RARα未被裂解，其发生APL的概率仅为2%～3%，远低于富含NE的早期髓细胞，进一步证实了NE这一切割作用在APL发生中的重要性[3]。由此我们推测NE 介导的PML-RARα裂解产物参与APL的发生发展。因此，本研究就PML-RARα裂解产物之一PML(NLS-)蛋白在白血病细胞体外增殖和凋亡诱导的作用进行探讨。

A.NB4/Ad-PML(NLS-); B.NB4/ Ad-KZ; C.NB4图6 流式细胞仪检测各组NB4细胞的细胞周期Fig 6 Flow cytometry detects cell cycles of NB4 cells in various groups

A.NB4/Ad-PML(NLS-); B.NB4/ Ad-KZ; C.NB4图7 流式细胞仪检测各组NB4细胞的凋亡率Fig 7 Flow cytometry of apoptosis rates of NB4 cells in various groups

groupcellcycleG1 G2 Sapoptosisrate(%)non-control38.14±1.2517.45±1.4044.30±1.503.49±0.32Ad-KZ35.25±1.5015.37±1.5049.27±1.5229.55±0.58Ad-PML(NLS-)30.08±1.38*3.48±1.25*65.26±1.36*14.68±0.37*

*Plt;0.05 compared with Ad-KZ group and NC group.

本研究以来源于M3型白血病，带有t(15;17)易位，表达PML-RARα融合蛋白的早幼粒白血病细胞系NB4细胞作为研究对象，通过腺病毒介导PML(NLS-)过表达，体外模拟研究其对白血病细胞增殖凋亡的影响。利用重组腺病Ad-PML(NLS-)成功感染NB4细胞，并顺利表达目的蛋白。比较体外增殖能力，Ad-PML(NLS-)感染后，NB4细胞增殖能力较空载组和未感染组明显增强。检测细胞周期分布，发现Ad-PML(NLS-)感染细胞组S期细胞比例显著增高而G2期细胞比例明显减少。进入S期的细胞越多，其胞内DNA合成增强而增殖旺盛，提示PML(NLS-)可能通过促进细胞周期进程，而增强NB4细胞的体外增殖。进一步比较PML(NLS-)过表达对NB4细胞凋亡的影响发现，腺病毒感染后，NB4细胞的凋亡率较空白对照组明显上升，但Ad-PML(NLS-)感染组与Ad-KZ组相比较，凋亡率却明显降低，说明PML(NLS-)可以抑制病毒诱导的细胞凋亡。已知PML蛋白参与多条凋亡途径，影响Ca2+依赖的凋亡刺激信号传递[10]，提示PML(NLS-)可能阻断了凋亡信号的传递，从而抑制凋亡。

综上所述，本研究明确了PML(NLS-)的过表达可增强白血病NB4细胞的体外增殖能力，并抑制病毒诱导的凋亡。深入探讨PML(NLS-)对白血病细胞的生物学特性的影响，将为阐明APL的发病机制提供新的理论依据。

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Effect of adenovirus-mediated PML (NLS-) over-expressionon the proliferation and apoptosis of NB4 leukemic cells

YANG Xiao-qun1, 2, WANG Hui2, JIANG Kai-ling2, ZHU Xin-yu2, MA Peng-peng2, LIU Bei-zhong1, 2*

(1.Central Laboratory of Yongchuan Hospital, Chongqing Medical University, Chongqing 402160; 2.Key Laboratory ofLaboratory Medical Diagnostics，Ministry of Education，Faculty of Laboratory Medicine，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China)

ObjectiveTo investigate the effect of PML (NLS-) on proliferation and apoptosis of leukemic NB4 cells by the over-expression of PML(NLS-) induced by adenoviruses.MethodsRecombinant adenovirus plasmid Ad-PML (NLS-) was digested and linearized with Pac I enzyme then transfected into AD293 cells. After amplification the recombinant adenovirus Ad-PML(NLS-) for four times, recombinant adenovirus titer was examined. Infection efficiency was detected by fluorescence microscopy and flow cytometry, the transcription and expression level of PML(NLS-) in NB4 cells were detected by RT-PCR and Western blot. Cell proliferation was detected by MTT. Cell cycle and apoptosis were detected by flow cytometry.ResultsRecombinant adenovirus plasmid Ad-PML (NLS-) was exactly digested and sequenced. The titer of amplified virus was 1×1010pfu/mL.

The efficiency of transfection was 75%, and PML(NLS-) had a high level expression in NB4 cells. The activity of cell proliferation in NB4 cells was significantly enhanced as compared to the untransfected and empty viral vector (Plt;0.05). The proportion of cells in S phase was obviously increased while which was obviously decreased in G1 phase. The rate of apoptosis in the experimental group was obviously lower than the empty viral vector.ConclusionsThe over-expression of PML(NLS-) may promote the proliferation of NB4 cellsinvitroand inhibit the apoptosis.

PML(NLS-); acute promyelocytic leukemia; proliferation; apoptosis

2014- 03- 13

2014- 05- 27

国家自然科学基金(81171658)；重庆市自然科学基金计划重点项目(2011BA5037)

*通信作者(correspondingauthor)：lbz2753@qq.com

1001-6325(2014)10-1327-06

R 557

A