阿托伐他汀通过转录因子AP1抑制AS大鼠VSMC增殖及促凋亡

李玉媚，王 辉*，康 敏，张文宇，陈 伟，胡 楠，欧和生*

(广西医科大学 1.药学院; 2.第一附属医院 耳鼻喉科，广西 南宁 530021)

研究论文

阿托伐他汀通过转录因子AP1抑制AS大鼠VSMC增殖及促凋亡

李玉媚1，王 辉1*，康 敏2，张文宇1，陈 伟1，胡 楠1，欧和生1*

(广西医科大学 1.药学院; 2.第一附属医院 耳鼻喉科，广西 南宁 530021)

目的探讨阿托伐他汀对动脉粥样硬化(AS)大鼠主动脉平滑肌细胞(VSMC)调节及转录因子AP1的作用。方法80只大鼠随机分为: 普通饲料组、AS组和阿托伐他汀高低剂量组(40和10 mg/kg·d)。用原位TUNEL检测细胞凋亡；用免疫组化检测血管中AP1和α-SM-actin蛋白表达；用蛋白免疫印迹法检测血管相关蛋白AP1表达。结果阿托伐他汀高和低剂量组TG、TC和LDL明显下降(Plt; 0.05)。阿托伐他汀抑制AS大鼠VSMC增殖，促进其促凋亡(Plt;0.05)。阿托伐他汀干预后AS大鼠VSMC中AP1和α-SM-actin蛋白表达明显减少(Plt;0.05)。结论阿托伐他汀通过下调AP1抑制AS大鼠VSMC增殖及促凋亡。

阿托伐他汀; 血管平滑肌细胞；AP1；α-SM-actin

血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)表型改变及调控是AS最重要和关键因素。VSMC的正常增殖与分化是维持血管正常功能的必要条件。他汀类药物通过改善血管内皮细胞功能、抑制炎性反应、抑制VSMC增生和凋亡、减少脂质在血管内皮层的沉积及泡沫细胞形成、抑制血小板的活性和聚集等, 从而达到稳定斑块的作用[1- 2]。AP1与VSMC表型转变及VSMC增殖、凋亡、分化和迁移的发生发展密切相关[3]。本研究探讨阿托伐他汀对AS大鼠VSMC增殖和凋亡的影响及AP1的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

AP1单克隆抗体和α-SM-actin抗体(Santa Cruz 公司)；SABC(鼠 IgG)POD试剂盒(广州锐博生物科技有限公司)；DAB显色试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)；ECL(Invitrogen公司)；辣根过氧化物酶结合抗体(南宁博仁生物科技有限公司)。

1.2 实验动物

SPF级SD大鼠(体质量250～300 g) 80只，雌雄各半，由广西医科大学动物实验中心提供，动物许可证号：[SCXK(桂)2010- 0003]。随机均分为：普通饲料组、动脉硬化组和阿托伐他汀高低剂量组。

静脉取血，用全自动生化仪测定血脂，以各组生化指标显著升高为造模成功标志。在前10周,阿托伐他汀组喂养同AS组，后5周分别每日加温水灌服阿托伐他汀(10 mg/kg)、(40 mg/kg)[4]。

1.3 方法

1.3.1 血脂测定：各组动物分别在第15周结束后，经中央动脉采血，将2 mL动脉血静置后，以酶比色测定法检测血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL)。

1.3.2 组织形态学的检查：分离胸主动脉，用10%甲醛溶液固定、石蜡包埋、3～4 μm厚度切片。常规脱蜡和脱水后HE染色，观察AS病变情况。

1.3.3 TUNEL检测细胞凋亡：石蜡切片脱蜡及水化后，经封闭、透化后加入TUNEL 反应液，于37 ℃孵育60 min，用DAB 法显色。

1.3.4 免疫组化方法检测AP1和α-SM-actin蛋白表达：石蜡切片脱蜡和水化， PBS洗3次，0.01 mol/L柠檬酸盐液热修复抗原90 s。接着PBS洗3次，室温孵育15 min。PBS洗3次，非免疫血清封闭40 min，室温下孵育10 min。除去血清，滴加Ⅰ抗AP1(1∶400)或α-SM-actin(1∶500)，37 ℃下孵育1 h。再滴加二抗体IgG(1∶300)，置于室温20 min，PBS洗3次。滴加DAB显色。滴加苏木精复染2 min，盐酸分化，PBS洗10 min。最后脱水、封片。显微镜下观察，随机选取10个视野，计算吸光度值，取平均值。

1.3.5 Western blot检测蛋白质表达：提取VSMC总蛋白，取50 μg蛋白质在8%SDS-PAGE上电泳，后电转至PVDF膜上，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，将膜加入AP1(工作浓度1∶1 000)并在4 ℃孵育过夜。TBST缓冲液洗膜3次，每次10 min．二抗(辣根过氧化物酶结合的抗体(工作浓度1∶1 000)杂交，37 ℃孵育45 min，TBST缓冲液洗膜3次，每次10 min。将膜与化学发光检测试剂反应2 min：A、B混合溶液激发荧光,在暗室X线曝光，显影、定影后进行图像分析。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 阿托伐他汀对AS大鼠血脂的影响

与正常组比较，AS组TG、TC与LDL明显升高(Plt;0.05)；与AS组比较，阿托伐他汀高及低剂量组TG、TC与LDL显著下降 (Plt;0.05)。

2.2 阿托伐他汀对AS大鼠主动脉形态的影响

普通饲料组大鼠主动脉内膜光滑完整，未见增生。平滑肌层与中层弹力膜相间排列且整齐，内皮与内弹性膜紧贴，内膜不剥脱(图1A)。AS组大鼠主动脉内膜损伤、增生，中层VSMC大量增生并向内膜迁移且紊乱，中膜弹性纤维断裂，粥样斑块向外凸出并破裂 (图1B)。阿托伐他汀高剂量组内膜损伤明显减轻，内膜增生显著减少，血管壁变薄(图1C)。阿托伐他汀低剂量组内膜损伤减轻，内膜增生减少，血管壁变薄(图1D)。

2.3 阿托伐他汀对AS大鼠VSMC凋亡的影响

与对照组比较，AS组VSMC呈棕褐色，包括核膜皱缩及胞核的崩解，表达增多(Plt;0.01)；与AS组比较，阿托伐他汀高及低剂量细胞凋亡率明显增加(Plt;0.01)。高剂量组凋亡率比低剂量组增加更显著(Plt;0.05) (表1，图2)。

2.4阿托伐他汀对动脉硬化大鼠VSMC特异性α-SM-actin蛋白的影响

4组大鼠胸主动脉的中膜均呈阳性染色、AS组和阿托伐他汀高、低剂量组的增生内膜及中膜呈高表达。与对照组对比,α-SM-actin在AS组表达显著增加(Plt;0.01)；与AS对比，α-SM-actin在阿托伐他汀高及低剂量组表达明显下降(Plt;0.01)(表1，图3)。

A.control group；B.AS group；C.high-dose atorvastatin group；D.low-dose atorvastatin group图1 大鼠胸主动脉组织形态学改变Fig 1 Thoracic aortic morphological changes in rats(HE×200)

A.control group；B.AS group；C.high-dose atorvastatin group；D.low-dose atorvastatin group图2 阿托伐他汀对平滑肌细胞凋亡影响Fig 2 Effect of the atorvastatin on apoptosis of VSMC(×200)

A.control group；B.AS group；C.high-dose atorvastatin group；D.low-dose atorvastatin group图3 阿托伐他汀对α-SM-actin蛋白表达影响Fig 3 Effect of the atorvastatin on α-SM-actin protein expression(×400)

groupapoptosisindexAvaluerate(%)control 8.5±1.575.74±5.32—AS25.3±2.1*45.35±4.25*67.01high-doseatorvastatin33.5±2.4*#64.42±5.62*#42.05low-doseatorvastatin30.2±2.4*#58.34±5.43*#28.6

*Plt;0.01 compared with control；#Plt;0.05 compared with AS.

2.5 阿托伐他汀对AS VSMC AP1蛋白影响

免疫组化检测AP1蛋白表达，AP1阳性染色呈棕黄色。与对照组对比, AP1在AS组表达显著增加(Plt;0.05)；与AS对比，AP1在阿托伐他汀高及低剂量组表达明显下降(Plt;0.01)(表2，图4)。

2.6 阿托伐他汀抑制AP1蛋白表达

与对照组对比, AP1蛋白表达在AS组表达显著增加(Plt;0.05)；与AS对比，AP1蛋白表达在阿托伐他汀高及低剂量组表达明显下降(Plt;0.01)(表2，图5)。

A.control group；B.AS group；C.high-dose atorvastatin group；D.low-dose atorvastatin group图4 阿托伐他汀对AP1蛋白表达的影响Fig 4 Effect of the atorvastatin on AP1 protein expression(×400)

groupAvaluerate(%)Avaluerate(%)control 52.67±4.52— 1.32±0.06—AS 40.52±3.41*-23.07 1.70±0.03*-28.78high-doseatorvastatin 65.52±6.35**#61.70 0.45±0.02**#73.53low-doseatorvastatin 61.32±7.43**#51.33 1.02±0.05**#40.00

*Plt;0.05，**Plt;0.01 compared with control；#Plt;0.05 compared with AS.

1.control group；2.AS group；3.high-dose atorvastatin group；4.low-dose atorvastatin group图5 阿托伐他汀对AP1蛋白表达影响Fig 5 Effect of atorvastatin on AP1 protein expression

3 讨论

阿托伐他汀在AS发生发展过程中发挥重要作用[5]。本文探讨阿托伐他汀对AS大鼠VSMC增殖和凋亡的影响及AP1的作用。研究发现，阿托伐他汀通过下调AP1抑制AS大鼠VSMC增殖及凋亡。

VSMC和内皮细胞增殖和凋亡是AS病变主要原因，而VSMC增殖和凋亡起主导作用[6]。阿托伐他汀具抗氧化、调节细胞钙稳态及细胞凋亡等作用[7]。本研究发现，阿托伐他汀高及低剂量组α-SM-actin蛋白表达下降且凋亡率提高。提示阿托伐他汀促进AS大鼠VSMC凋亡，起到延缓AS发生和发展的作用。

AP1参与细胞生长调控，AP1蛋白表达水平与VSMC增殖密切相关[8]。此外，AP1与Ras有丝分裂信号共同参与VSMC生长[9]。一些转录因子在细胞增殖、凋亡过程中扮演重要角色，细胞增殖能力降低与一些转录因子：AP1, SP1,HSF-1,E2F表达水平下降有关[10]。此外，AP1(c-fos和c-jun)是G1期进程关键控制点[11]。因此，选AP1检测，结果发现，阿托伐他汀通过下调AP1抑制AS大鼠VSMC增殖及凋亡。另外，不同剂量他汀类药物通过调脂和非调脂协同作用，可有效预防AS及血管成形术后再狭窄。高剂量组阿托伐他汀对AS大鼠VSMC抑制更加明显。该作用机制可能是阿托伐他汀通过调节AP1表达水平而影响VSMC增殖及凋亡。但AP1参与VSMC增殖的分子作用机制尚不清楚。

综上所述，本研究阐明阿托伐他汀与某些转录因子调控细胞的分子机制，AP1可能介导阿托伐他汀在VSMC增殖或凋亡中起调控作用。本研究为研究心血管疾病靶点提供一种新方法，其潜在临床应用也具有重要现实意义。

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Atorvastatin inhibits the proliferation andptomotes apoptosis of VSMC by the transcription factor AP1 in rats

LI Yu-mei1, WANG Hui1*, KANG Min2, ZHANG Wen-yu1, CHEN Wei1, HU Nan1, OU He-sheng1*

(1.College of Pharmacy,Guangxi Medical University;2.Dept. of Ear-nose-throat, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University,Nanning 530021,China)

ObjectiveTo investigate effect of atorvastatin to inhitit proliferation and to promote apoptosis of VSMC by the transcription factor AP1 in rats.MethodsEighty rats were randomly divided into four groups: normal group,AS group, high-dose atorvastatin group (40 mg/kg·d), low-dose atorvastatin group (10 mg/kg·d).The VSMC apoptosis was detected by TUNEL assay.The protein expression level of AP1 and α-SM-actin were measured by immunohistochemical analysis and Western blot.ResultsTG, TC and LDL were significantly decreased in two atorvastatin groups (Plt;0.05). Atorvastatin significantly inhibited the VSMC proliferation and induced apoptosis (Plt;0.05). Atorvastatin regulated AP1 and α-SM-actin protein expression significantly decreased(Plt;0.05).ConclusionsThe atorvastatin suppresses proliferation and promotes apoptosis of VSMC through down-regulation of AP1 expression in rats suppressing AP1 expression in VSMC.

atorvastatin; vascular smooth muscle cell;AP1；α-SM-actin

2014- 03- 20

2014- 05- 27

国家自然科学基金(81373403); 广西硕士研究生科研创新项目(YCSZ2013031)

*通信作者(correspondingauthor)：hsouol@yahoo.com; 465580297@qq.com

1001-6325(2014)10-1339-05

R 97

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