川芎嗪对小鼠哮喘模型Th17 细胞的调控作用以及对Th17、Treg 细胞平衡的影响

姜 晖 陈霞霞 王金艳 薛云飞 (河北省唐山市工人医院药剂科，唐山 063000)

支气管哮喘是一种慢性的呼吸系统疾病，严重威胁人类的健康［1，2］。近年来，支气管哮喘在世界各国的发病率均有上升，且儿童的哮喘患病率也逐年攀升，支气管哮喘已逐渐成为严重危害成人与儿童健康的公共卫生问题。但是目前的研究尚未能完全阐明哮喘的发病机制［3，4］。研究表明，支气管哮喘是由嗜酸性粒细胞、肥大细胞以及T 淋巴细胞等多种细胞共同参与的一种气道炎症。各种细胞在气道内聚集，进而释放细胞因子以及炎症介质引起气道功能发生障碍。而T 淋巴细胞在炎症反应中发挥着重要的作用。Th17 细胞以及Treg 细胞是独立的CD4+T 细胞亚群，Th17 细胞主要通过分泌IL-17来发挥免疫作用，在炎性反应以及免疫调节中发挥着重要的作用。而Treg 细胞通过与其他细胞直接接触和/或分泌一些抑制性的细胞因子如TGF-β、IL-10 等发挥免疫负调控的作用［5］，通过Treg 细胞功能的发挥，可以控制效应T 细胞的反应强度，从而防止过度免疫反应对机体造成的病理损害。

川芎嗪是一种在临床应用已久的中药，其具有作用靶点多、副作用小，在治疗哮喘方面疗效确切的优点［6，7］，但是其在哮喘中的作用机制尚不清楚［8，9］，本研究通过建立小鼠哮喘模型，观察川芎嗪对小鼠Th17、Treg 细胞的影响，探讨川芎嗪在治疗哮喘中的机制，以期进一步为临床治疗哮喘提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物以及动物模型建立 雄性BALB/c 小鼠40 只，6～8 周龄，体重为22～24 g。随机将小鼠分成四组，分别为正常对照组、哮喘模型组、川芎嗪治疗组以及激素治疗组，其中哮喘模型组、川芎嗪治疗组以及激素治疗组在第0、7、14 天给予含0.1%OVA 的0.1 ml Al(OH)3腹腔注射，并在第21 天开始用含2%的OVA 生理盐水溶液10 ml 进行雾化吸入30 min;川芎嗪治疗组小鼠在第0、7、14 天以及每次雾化吸入前30 min 腹腔注射川芎嗪80 mg/kg;激素治疗组小鼠在第0、7、14 天以及每次雾化吸入前30 min 腹腔注射地塞米松注射液0.5 mg/kg;正常对照组用生理盐水替代OVA 进行腹腔注射以及雾化吸入。

1.2 标本收集 眼球取血后处死小鼠，取200 μl加PBS 稀释至3 ml，缓慢加入至小鼠淋巴细胞分离液上，保持分层，4℃、1 500 r/min、10 min，取中间白色的淋巴细胞层，用3 ml PBS 重悬后离心，弃上清。其余的血液静置2 h 后离心，4℃、2 000 r/min、15 min，取上层血清分装保管于-80℃冰箱。解剖小鼠后，取左下肺叶，用10%的甲醛固定后，脱水、石蜡包埋、切片，常规HE 染色。

1.3 ELISA 测定血清中IL-17、IL-10 的水平 按照ELISA 试剂盒说明书进行检测血清中IL-17、IL-10的水平，用酶标仪在450nm 处测定OD 值。

1.4 流式细胞仪检测Th17 细胞、Treg 细胞比例 心脏灌洗后取小鼠肺组织剪成约3 cm ×2 cm 的小块，用IV 型胶原酶在37℃消化3 h，过膜后4℃、2 750 r/min× g，7 min，percoll 离心，弃上清，加入40%细胞后，4℃、2 000 r/min，20 min，取中间的一层细胞用PBS 洗2 遍，离心弃上清后计数取稀释的细胞悬液，每管含1 ×106个细胞，分别加入CD4、CD25、IL-17 抗体或者CD4、CD25 抗体，破膜固定后加入FoxP3 抗体，混匀后避光孵育30 min，加3 ml PBS，4℃、1 500 r/min、5 min，弃上清，用500 μl 2%的多聚甲醛固定后待测。

1.5 统计学分析 数据采用SPSS11.5 统计学软件进行分析，计量数据用±s 表示，组间比较采用方差分析，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 四组小鼠的症状观察 在每次致敏和雾化吸入后，观察四组小鼠的症状，发现在第1 次致敏后，各组小鼠表现无差异。在第2 次致敏后，哮喘模型组、川芎嗪治疗组及激素治疗组小鼠出现伏地不动和毛发竖起的现象，而正常对照组小鼠未发现上述现象。在雾化吸入后，哮喘模型组小鼠出现呼吸急促、鼻翼煽动、烦躁不安、反应迟钝、排泄物增多等现象。川芎嗪治疗组及激素治疗组小鼠表现较轻微，仅有活动减慢、精神轻度萎靡的现象，正常对照组小鼠活动良好。

2.2 四组小鼠的肺组织病理检查 各组小鼠组织切片HE 染色后在光镜下观察发现，正常对照组小鼠肺部纹理致密，未见炎症细胞。哮喘模型组小鼠支气管管腔变小，管壁增厚，并且肺泡间隙增宽，在支气管和小血管周围发现大量的嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、巨噬细胞等炎性细胞浸润。而治疗组小鼠的肺组织切片中仅发现少量的炎性细胞，见图1。

2.3 四组小鼠外周血中Th17 细胞以及Treg 细胞比例 通过流式细胞仪分析四组小鼠外周血中Th17 细胞和Treg 细胞占总CD4+T 细胞的比例发现，正常对照组小鼠的Treg 细胞以及Th17 细胞的比例为正常范围，哮喘模型组小鼠的Treg 细胞较正常组小鼠比例明显降低，而Th17 细胞占CD4+T 细胞显著升高;川芎嗪治疗组小鼠以及激素治疗组小鼠的变化趋势一致，Treg 细胞以及Th17 细胞的比例趋于正常，见图2、3。

2.4 ELISA 测定血清中IL-17、IL-10 的水平 IL-17是Th17 细胞主要分泌的细胞因子，而IL-10 是Treg细胞发挥抑制作用的主要细胞因子。通过ELISA法检测各组小鼠血清中的IL-17、IL-10 的水平，发现正常对照组小鼠血清中IL-17 以及IL-10 的水平在正常范围内，分别为(10.21±2.11)、(57.37±3.29)ng/ml，而哮喘模型组小鼠的IL-17 的水平达到了(23.6±2.19)ng/ml 显著高于正常对照组小鼠(t=13.283，P=0.000)，IL-10 的水平为(17.38±4.62)ng/ml 较正常对照组小鼠显著降低(t=11.748，P=0.000)，川芎嗪治疗组小鼠的IL-17 水平为16.22±2.37 ng/ml 较哮喘模型组小鼠明显降低(t=9.462，P=0.000)，而IL-10 的水平为40.27±1.28 ng/ml显著升高(t=11.374，P=0.000)，激素治疗组小鼠的变化趋势与川芎嗪治疗组小鼠一致，见图4。

图1 四组小鼠的肺组织HE 染色(光学显微镜，×200)Fig.1 Mice lung tissue HE staining of four groups(Optical microscope，×200)

图2 Treg 细胞以及Th17 细胞占CD4 +T 细胞比例的流式图Fig.2 Flow chart of Treg cells and Th17 cells accounted for proportion of CD4 +T cells

图3 Treg 细胞以及Th17 细胞占CD4 +T 细胞比例的统计图Fig.3 Statistical chart of Treg cells and Th17 cells accounted for proportion of CD4 +T cells

图4 血清中IL-17、IL-10 的水平Fig.4 Level of serum IL-10 and IL-17

3 讨论

支气管哮喘是一种常见的以气道高反应性和可逆性气道阻塞为主要特征的变态反应性疾病。支气管哮喘会导致气道反应增高，气道黏膜细胞会分泌大量的黏液，出现不可逆的气流受限［10］。在支气管哮喘的病理过程中，有多种细胞如肥大细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞以及T 淋巴细胞等都参与了炎症反应。研究表明，气道的高反应性与Th1 细胞受到抑制以及Th2 细胞功能亢进有关［11，12］，但是近年来的研究发现，Th1 细胞与Th2 细胞的失衡不能解释所有的发病机制。大量的研究表明，Th17 细胞和Treg 细胞在支气管哮喘的发生发展过程中发挥着非常重要的作用［13］。

川芎嗪是一种从中药川芎中提取出来的一种生物碱，川芎嗪有活血化瘀、祛风止痛、行气的功效。研究发现，川芎嗪是一种钙离子拮抗剂，可以明显抑制不同因素引起的平滑肌细胞的钙离子内流，可能与影响气道重建有关［14，15］。研究发现在豚鼠的哮喘模型中，川芎嗪可以提高外周血中Treg 细胞的比例，对由Th2 细胞介导的呼吸道变应性炎症发挥强大的抑制效应。本研究结果显示川芎嗪能够明显地减少OVA 诱导哮喘小鼠模型肺组织中Th17 细胞占CD4+T 细胞的比例以及IL-17 的表达水平，其机制可能是通过促进Treg 细胞的生长、增殖以及IL-10等抑制性细胞因子的分泌预防或控制哮喘的发生。

本研究设立了生理盐水诱导的正常小鼠作为阴性对照组，致敏原OVA 诱导的哮喘模型组，川芎嗪治疗的小鼠以及激素治疗的阳性对照组。通过观察小鼠的症状、肺组织的病理图片以及各组小鼠外周血中Th17 细胞以及Treg 细胞比例以及血清中IL-17、IL-10 的水平，发现小鼠哮喘模型的Treg 细胞受到明显抑制而Th17 细胞的比例升高，诱导过程中给予川芎嗪及地塞米松治疗组，可以有效地阻止这种变化，从而减轻哮喘的症状，预防/控制哮喘发生，为有效控制支气管哮喘发作提供有效的治疗途径。

本研究结果提示川芎嗪可以通过增强Treg 细胞的功能，增加Treg 细胞的数量，进而抑制Th17 细胞的数量以及功能，减轻Th17 细胞的应答，降低IL-17 细胞因子的分泌，达到预防/控制哮喘发生、减轻哮喘症状的疗效。

［1］罗谷容.支气管哮喘护理进展［J］.广西医学，2002，24(7):1031-1034.

［2］Murata A，Ling PM.Asthma diagnosis and management［J］.Emerg Med Clin North Am，2012，30(2):203-222.

［3］Passalacqua G.Specific immunotherapy:beyond the clinical scores［J］.Ann Allergy Asthma Immunol，2011，107(5):401-406.

［4］Uhm TG，Kim BS，Chung IY.Eosinophil development，regulation of eosinophil-specific genes，and role of eosinophils in the pathogenesis of asthma［J］.Allergy Asthma Immunol Res，2012，4(2):68-79.

［5］Tatler AL，John AE，Jolly L，et al.Integrin alphavbeta5-mediated TGF-beta activation by airway smooth muscle cells in asthma［J］.J Immunol，2011，187(11):6094-6107.

［6］Zhang XP，Jiang J，Cheng QH，et al.Protective effects of Ligustrazine，Kakonein and Panax Notoginsenoside on the small intestine and immune organs of rats with severe acute pancreatitis［J］.Hepatobiliary Pancreatic Dis Int，2011，10(6):632-637.

［7］王文建，杨 莉，王西华，等.川芎嗪对哮喘大鼠气道壁嗜酸细胞浸润和转化生长因子-β1 表达的影响［J］.南京医科大学学报(自然科学版)，2005，10:716-718.

［8］Ren M，Dong J，Xu Y，et al.Synthesis of novel ligustrazine derivatives as NA +/H+exchange inhibitors［J］.Chem Biodivers，2010，7(11):2727-2736.

［9］Xue Y，Tie CR，Li J，et al.Ligustrazine inhibits lipopolysaccharideinduced proliferation by affecting P27，Bcl-2 expression in rat mesangial cells［J］.Eur J Pharmacol，2011，665(1-3):8-12.

［10］梁秀云，蒙春华，莫诚航，等.支气管哮喘患者血清IL-4、TNF-α 及IgE 水平变化及临床意义［J］.现代生物医学进展，2012，12(20):3864-3866，3884.

［11］Oliphant CJ，Barlow JL，McKenzie AN.Insights into the initiation of type 2 immune responses［J］.Immunology，2011，134(4):378-385.

［12］魏文君.川芎嗪对哮喘患者白介素-4、干扰素-γ 的影响及对Th1/Th2 细胞因子平衡失调的干预作用［J］.实用医学杂志，2009，25(5):743-745.

［13］Shi YH，Shi GC，Wan HY，et al.Coexistence of Th1/Th2 and Th17/Treg imbalances in patients with allergic asthma［J］.Chin Med J，2011，124(13):1951-1956.

［14］Che XW，Zhang Y，Wang H，et al.Effect of ligustrazine injection on levels of interleukin-4 and interferon-gamma in patients with bronchial asthma［J］.Chin J Integr Med，2008，14(3):217-220.

［15］Xiong L，Fang ZY，Tao XN，et al..Effect and mechanism of ligustrazine on Th1/Th2 cytokines in a rat asthma model［J］.Am J Chin Med，2007，35(6):1011-1120.