烟草贮藏过程中TSNAs含量变化及对高温处理的响应

王瑞云，史宏志，周骏，白若石，杨惠娟，马雁军，吴疆，杨兴有，孙军伟

1 河南农业大学,国家烟草栽培生理生化研究基地,郑州450002；

2 北京卷烟厂,北京100024；

3 四川省达州烟草公司,达州 635000；

4 云南省烟草公司大理州公司 671000

烟草贮藏过程中TSNAs含量变化及对高温处理的响应

王瑞云1，史宏志1，周骏2，白若石2，杨惠娟1，马雁军2，吴疆1，杨兴有3，孙军伟4

1 河南农业大学,国家烟草栽培生理生化研究基地,郑州450002；

2 北京卷烟厂,北京100024；

3 四川省达州烟草公司,达州 635000；

4 云南省烟草公司大理州公司 671000

以我国云南宾川白肋烟，四川达州晒烟，河南宝丰烤烟调制后的上二棚叶为 供试样品，在1年的自然贮藏过程中每隔4个月分别对白肋烟和晒烟取样研究TSNAs含量的变化，另将3种不同类型的烟草在低温（10℃）和高温（45℃）条件下处理研究高温条件对贮藏过程中TSNAs含量的影响。结果表明，白肋烟和晒烟中的TSNAs总量及各成分含量均随着贮藏时间的增加而增加，且在外界温度较高即4月 中旬至8月中旬增加幅度最为显著，而各组分中NNN的含量变化最为明显，其中尤以白肋烟的变化幅度更甚。不同类型烟草中，硝酸盐含量较低的烤烟中TSNAs总量及各成分含量很低，且在45℃处理前后的变化不明显，硝酸盐含量较高的白肋烟和晒烟的TSNAs总量及各成分含量也较高，在45℃处理后迅速增加，且其硝酸盐的含量均有所下降，亚硝酸盐含量明显升高。

白肋烟；烟草特有亚硝胺；温度；硝酸盐

烟草特有亚硝胺(TSNAs)是烟草中最主要的有害成分之一，自60年代以来一直是国际烟草减害研究的重点[1]。烟草特有亚硝胺主要有4种：N-亚硝基降烟碱（NNN）、4-(甲基亚硝氨)-1-（3-吡啶基）-1-丁酮（NNK）、N-亚硝基新烟草碱(NAT)、N-亚硝基假木贼碱(NAB)，其中NNN和NNK已被证明具有动物致癌性[2-9]。TSNAs是仲胺类生物碱和亚硝酸盐反应生成的[10]。一般而言，在鲜烟叶中检测不到TSNAs或含量极低，烟叶中的TSNAs主要在调制和贮藏过程中形成和积累，但目前研究多集中在烟叶调制期间TSNAs的形成。Burton[11]和Cui[12]等对白肋烟的研究表明，TSNAs快速增长发生在调制过程中烟叶的变黄末期，即调制的第4周到第5周，且微生物活动使烟叶中的硝酸盐还原为亚硝酸盐是导致生物碱亚硝化反应而形成TSNAs的主要原因。白肋烟调制结束后的贮藏阶段是TSNAs形成的重要时期，烟叶贮藏阶段其TSNAs含量比调制结束可提高50%以上，De Rot on[13]等报道贮藏在环境温度下的白肋烟粉碎样品，6个月后TSNAs含量由1.3-1.4 μg/g增加到8.1-9.5 μg/g，而贮藏在冰箱里的样品TSNAs含量没有显著增加。Saito 等（2006）[14]也报道随着温度的增加，白肋烟贮藏烟叶TSNA含量和氮氧化物含量大幅增高。但目前贮藏期间TSNAs形成规律尚不明确，为此我们设计试验以探索贮藏期间TSNAs形成与环境温度的关系，从而阐明TSNAs的形成规律，为采取环境控制技术抑制TSNAs合成和积累，提高烟叶的安全性提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料均为典型产区2011年上二棚烟叶，其中白肋烟烟叶样品为云南大理宾川TN90，晒烟烟叶样品为四川达州万源万毛1号，烤烟烟叶样品为河南宝丰的中烟100。

1.2 试验方法

试验分贮藏试验和控制试验，其中贮藏试验研究烟叶在自然贮藏条件下不同时期烟叶化学成分含量的变化，每个类型和产地烟叶10 kg。控制试验是在人工控温控湿条件下研究环境条件对调制后烟叶TSNAs形成的影响，每个样品取5 kg，去梗切成0.5cm大小碎片，混合后置于冰柜中备用，控制实验分别设置了10℃、27℃、30℃、45℃、60℃系列实验，贮藏中的烟叶高温可达到45℃，故本文选取高温45℃并以低温10℃作对比以更好的说明温度对烟叶中TSNAs合成的影响最终为烟叶贮藏过程中温度的控制提供参考。具体试验方法如下：

1.2.1 贮藏试验：烟叶去梗后，切成3cm大小见方碎片，充分混匀后打包，进行第1次取样后置于自然条件下进行贮藏，之后每隔4个月取样1次，每次取样后将所取样品在冰柜中-6℃冷冻存放，1年后把所有样品同时进行冷冻干燥，磨碎供TSNAs和有关化学成分含量测定，样品共重复测定3次。

1.2.2 高温处理对不同类型烟叶TSNAs合成影响试验：分别取白肋烟、晒烟和烤烟样品10 g，置于恒温恒湿箱中进行处理，温度设定为45℃，另设10℃作为对照，相对湿度为60%。处理36天后，将样品冷冻干燥，磨碎待测，样品共重复测定3次。

1.3 化学成分含量测定

1.3.1 TSNAs含量测定：所有样品均送至美国肯塔基大学和上海烟草集团北京卷烟厂进行重复测定，美国肯塔基大学测定方法为气相色谱-热能分析联用仪(TEA)[15]，具体参数按Burton等方法进行。北京卷烟厂测定方法为GC-NPD法[16]，即将烟样超声波萃取，萃取液在硅藻土层析柱上层析，洗脱液浓缩后使用GC-NPD进行检测。

1.3.2 生物碱测定：生物碱测定采用气相色谱法。样品经烘干后粉碎，每样品称取100 mg，加0.5mL 2 mol/L NaOH湿润，再加5mL乙醚振荡1 h提取生物碱；气相色谱仪为Agilent-6890，检测器为FID,具体操作和参数设定按Burton等[15]的方法进行。

烟碱转化能力用烟碱转化百分率表示，即降烟碱含量占烟碱和降烟碱含量之和的百分比，可由下式计算[17]。

烟碱转化率=[降烟碱／(烟碱含量+降烟碱含量)]×100%

1.3.3 硝酸盐测定：烟叶样品送至美国肯塔基大学烟草化学分析实验室分析测定，采用比色法,具体参数按Burton等[15]方法进行。

2 结果与分析

2.1 不同类型烟草贮藏过程中TSNAs含量的变化

2.1.1 贮藏过程中NNK含量的变化

将在2011年12月中旬打包后自然贮藏的白肋烟和晒烟，每隔4个月定期取样，1年后同时测定烟叶TSNAs的含量。随着贮藏时间的增加，白肋烟和晒烟中的NNK含量均呈不断增加趋势（图1），且在2012年4月中旬至8月中旬增加达到显著水平，这个时期也正是温度较高的时期。

图1 不同类型烟草中NNK含量比较Fig.1 Content of NNK in different types of tobacco

2.1.2 贮藏过程中NNN含量的变化

如图2，在贮藏过程中，白肋烟和晒烟中的NNN含量总体呈不断增加趋势，但晒烟在一年贮藏中每四个月的增加量均未达到显著水平，白肋烟在2011年12月中旬至2012年4月中旬增长量很少未达到显著水平，2012年4月中旬至8月中旬，8月中旬至12月中旬NNN含量的增加量均达到显著水平，白肋烟NNN含量在贮藏期间的增加幅度远大于晒烟，这与所用的白肋烟烟碱转化率较高有关，烟碱转化导致降烟碱含量升高，更有利于NNN的形成。

图2 不同类型烟草中NNN含量比较Fig.2 Content of NNN in different types of tobacco

2.1.3 贮藏过程中NAT含量的变化

贮藏过程中，白肋烟和晒烟中的NAT含量随贮藏时间均不断增加，同样表现为增加幅度先小后大再减小的趋势。在2012年4月中旬至8月中旬增加量最大且均达到了显著水平，分别增加116.8%和135.6%。此外，白肋烟中的NAT含量始终高于晒烟中的NAT含量。

图3 不同类型烟草中NAT含量比较Fig.3 Content of NAT in different types of tobacco

2.1.4 贮藏过程中NAB含量的变化

在图4中，白肋烟在一年的贮藏期中每四个月的增加量均达到了显著水平，以4月中旬到8月中旬的高温季节增加最为显著。晒烟中的NAB含量在2011年12月至4月间缓慢增加未达到显著水平，在2012年4月中旬至8月中旬、8月中旬至12月中旬的增加达到了显著水平，且在12月中旬时白肋烟和晒烟中的NAB含量较接近。

图4 不同类型烟草中NAB含量比较Fig.4 Content of NAB in different types of tobacco

2.1.5 贮藏过程中TSNAs总量的变化

烟叶中的TSNAs总量变化趋势如图5，白肋烟和晒烟在2011年12月中旬至2012年4月中旬缓慢增加，增加量均未达到显著水平，在2012年4月中旬至8月中旬迅速增加，增加量均达到显著水平，之后增速减缓。在贮藏期间，白肋烟的TSNAs总量始终高于晒烟中的TSNAs总量，这一差异可能主要是NNN含量差异较大引起的。

图5 不同类型烟草中TSNAs总量比较Fig.5 Content of TSNAs in different types of tobacco

2.2 温度对不同类型烟草贮藏过程TSNAs及前体物含量的影响

2.2.1 温度对不同类型烟草中NNK含量的影响

将白肋烟、烤烟、晒烟样品分别放置在10℃、45℃下36天，测定烟叶TSNAs含量，如图6所示，将白肋烟、晒烟、烤烟在相同温度条件下分别进行多重比较，与白肋烟、晒烟相比较，烤烟的NNK含量较低，且对高温处理不表现响应。白肋烟、晒烟烟叶在45℃处理36天，与室温下烟叶相比，NNK含量大幅度增加，远高于同类烟叶在室温条件下(10℃)的含量。另外，晒烟无论在室温还是45℃处理下，NNK的含量均高于相同条件下白肋烟的含量且与相同条件下白肋烟的含量达到显著水平。

图6 不同类型烟草中NNK含量比较Fig.6 Content of NNK in different types of tobacco

2.2.2 温度对不同类型烟草中NNN含量的影响

图7表明，烤烟的NNN含量显著低于白肋烟和晒烟，且在45℃处理后含量不表现增加。白肋烟NNN含量最高，其次是晒烟，二者在45℃处理后NNN含量大幅度增加，45℃处理后的晒烟NNN含量是室温下的7.22倍。白肋烟在处理前后的NNN含量均高于晒烟。

图7 不同类型烟草中NNN含量比较Fig.7 Content of NNN in different types of tobacco

2.2.3 温度对不同类型烟草中NAT含量的影响

测定结果如图8，烤烟在处理前后的NAT含量变化不明显，且含量较少。白肋烟在45℃处理后的NAT含量是是室温的5.91倍，晒烟在45℃处理后的NAT含量是是室温的4.38倍，变化均较大。

图8 不同类型烟草中NAT含量比较Fig.8 Content of NAT in different types of tobacco

2.2.4 温度对不同类型烟草中NAB含量的影响

如图9所示，烤烟的NAB含量较低。白肋烟、晒烟在两种温度处理下NAB含量差别较大，45℃处理后的NAB含量与室温相比较，白肋烟达到了16.11倍，晒烟也达到了11.00倍，增加幅度很明显。

图9 不同类型烟草中NAB含量比较Fig.9 Content of NAB in different types of tobacco

2.2.5 温度对不同类型烟草中TSNAs总量的影响

根据4种TSNAs含量计算烟叶TSNAs总量，结果如图10，烤烟的TSNAs总量在两种温度条件下变化不显著。白肋烟和晒烟则表现为在高温下TSNAs含量大幅度增高，白肋烟和晒烟在45℃处理后的TSNAs总量分别是室温的5.81倍和5.89倍。白肋烟在室温和处理后的TSNAs总量均高于晒烟。

图10 不同类型烟草中TSNAs总量比较Fig.10 Content of TSNAs in different types of tobacco

2.2.6 不同类型烟草生物碱含量差异

不同烟草类型烟叶的生物碱含量有显著差异，白肋烟显著高于烤烟，但低于晒烟；白肋烟降烟碱含量显著高于烤烟和晒烟，烟碱转化率也高于其它两种类型烟草。将晒烟、白肋烟、烤烟样品分别放置在10℃、45℃下36天，其生物碱含量差异见表1，烤烟、白肋烟、晒烟在两种情况下的生物碱变化幅度均很小，烤烟的烟碱转化率在45℃下与室温相比略有降低，晒烟和白肋烟的烟碱转化率表现升高。

表1 不同类型烟草生物碱比较Tab.1 Alkaloids in different types of tobacco

2.2.7 不同类型烟草硝酸盐及亚硝酸盐含量差异

对3种类型烟草的硝酸盐和亚硝酸盐含量进行测定，结果见表2，结果表明，白肋烟硝酸盐含量大幅度高于烤烟，二者相差10-20倍，高硝酸盐含量是白肋烟烟叶化学组成上的一个显著特点。在2个温度条件下处理36天，烤烟烟叶的亚硝酸盐含量变化较小，硝酸盐含量表现在高温条件下增加。白肋烟和晒烟在45℃处理后亚硝酸盐含量均升高，硝酸盐含量则均呈现下降趋势，晒烟表现尤为显著。

表2 不同类型烟草硝酸盐比较Tab.2 Nitrates in different types of tobacco

3 讨论

白肋烟和晒烟调制后的贮藏阶段是烟草特有亚硝胺形成的重要时期，本研究结果表明，经过1年的贮藏，烟叶TSNAs含量大幅度增加，且以4月中旬到8月中旬的高温季节增加最为显著。研究中我们使用温湿度自动记录仪对贮藏环境的温度条件进行了实时测定，在自然贮藏的前4个月，贮藏环境平均温度仅为5.17℃，在第二个贮藏阶段，即4月中旬至8月中旬，平均温度增加到了25.67℃，日平均最高温度达到32℃，有47天的温度大于27℃而在此期间的白肋烟和晒烟的总TSNAs及其各成分含量增加量均很显著，其中白肋烟和晒烟的NNK含量增幅分别为93.7%和152.6%，NNN含量增幅分别为125.9%和65.9%。在随后的4个月中，环境温度降低为15.94℃，仅有2天的日均温度超过了27℃，此期间白肋烟和晒烟的总TSNAs及其各成分含量的增幅明显降低。可见温度对贮藏中烟叶的TSNAs含量变化可能有较大影响。白肋烟NNN含量增加幅度最大，并显著高于晒烟，这可能与白肋烟降烟碱含量以及烟碱向降烟碱转化率较高有关[19]。

不同类型烟草贮藏过程中TSNAs形成对高温的反应差异较大，烤烟在高温处理后TSNAs增加不显著，而白肋烟和晒烟增加幅度较大，这可能与不同类型硝态氮含量有密切关系。白肋烟和晒烟硝酸盐积累量远高于烤烟是其化学组成的显著特点，本试验中白肋烟硝态氮含量比烤烟高出近10倍。前期研究表明，在同一白肋烟产区烟叶TSNAs含量与硝酸盐含量为正相关关系[20]。硝态氮具有化学不稳定性，在高温条件下易生成挥发性的亚硝酸盐或一氧化氮等气态氮氧化物 ，其可直接与烟草生物碱发生亚硝化反应生成TSNAs。本研究表明白肋烟和晒烟高温处理后硝态氮含量降低，亚硝酸盐含量增高，这与前人研究结果相吻合[14]。高温造成气态氮氧化物含量增加这可能是晾晒烟在高温条件下贮藏造成TSNAs增高的重要原因，也是我们下一步研究的重点。

4 结论

（1）白肋烟和晒烟在1年的自然贮藏过程中，烟叶中的TSNAs含量随着贮藏时间的增加而持续增加，且以4月中旬～8月中旬的高温季节增加更为显著，在TSNAs各组分中NNN含量最高，且增幅较大，尤以白肋烟更甚。

（2）不同类型烟叶在贮藏过程中对高温的反应差异显著，白肋烟和晒烟在45℃处理36天后TSNAs含量大幅增加，而烤烟增加不显著。

（3）白肋烟和晒烟硝酸盐含量大幅度高于烤烟，在高温处理后含量下降，亚硝酸盐含量显著上升。高温和高硝态氮含量可能是造成烟叶贮藏过程中TSNAs含量增加的主要原因。

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Changes in TSNAs contents during tobacco storage and its response to high temperature treatment

WANG Ruiyun1,SHI Hongzhi1,ZHOU Jun2,BAI Ruoshi2,YANG Huijuan1,MA Yanjun2,WU Jiang1,YANG Xingyou3,SUN Junwei4

1 National Tobacco Physiology and Biochemistry Research Center,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China;
2 Beijing Cigarette Factory,Beijing 100024,China;
3 Sichuan Dazhou Tobacco Company,Dazhou 635000,China;
4 Yunnan Dali Tobacco Company,Dali 671000,China

Samples of Binchuan burley tobacco,Dazhou sun-cured tobacco and Baofeng flue-cured tobacco were collected to investigate changes in TSNAs contents during storage and their response to different temperature treatment.Results showed that both total and individual TSNAs contents in both burley and sun-cured tobacco increased with increase of storage time.The most signi ficant increase occurred in high temperature months,for example,from middle of April until August,especially for NNN in burley tobacco.Both total and individual TSNAs contents in flue-cured tobacco which had less nitrate contents were very low and showed non-signi ficant changes after 45℃ treatment.While both total and individual TSNAs contents in burley tobacco and sun-cured tobacco were much higher and increased rapidly after the treatment of 45℃,with nitrate decreasing slightly and nitrite rising signi ficantly.

burley tobacco; TSNAs; temperature; nitrate

10.3969/j.issn.1004-5708.2014.01.009

S572.09

A

1004-5708（2014）01-0048-06

国家烟草专卖局科技重大专项“选择性降低卷烟烟气中NNK释放量研究”(JZ12006)

王瑞云(1988—)，在读硕士研究生，主要从事烟草栽培生理研究，Email:wry8802@163.com

史宏志(1963—)，博士，教授，博士生导师，主要从事烟草栽培生理研究，Email：shihongzhi88@163.com

2013-03-04